補腎活血方對骨質(zhì)疏松癥大鼠Smurf1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的影響

石樹培，陳 鵬，林海仙，劉蔚楠，朱 瑋，韓 海，鄭春盛，楊 直

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨量減少以及骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)退變?yōu)樘卣鳎橛泄谴嘈栽黾右约肮钦埏L(fēng)險增高的一種全身性的骨骼疾?。?］。隨著我國逐漸步入老齡化社會，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率也逐年上升，目前已成為老年人常見疾病之一。骨質(zhì)疏松癥的致病原因有多種，包括年齡、內(nèi)分泌的紊亂、鈣平衡的失調(diào)、免疫、營養(yǎng)、遺傳等，其致病機制主要和骨代謝失調(diào)相關(guān)。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥主要以腎虛血瘀證為多見［2-3］。因此，臨床上以補腎壯骨、活血化瘀，輔以調(diào)補脾腎、補益肝腎治療［4］。本研究基于泛素蛋白酶體復(fù)合通路（UPP）以及TGF-β／Smads通路，通過研究Smad泛素調(diào)節(jié)因子1（Smurf1）在用藥前后的蛋白表達量變化，來探討補腎活血方治療骨質(zhì)疏松癥大鼠的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選用4～5月齡雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±50）g，未曾交配，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于福建省骨科研究所。

1.2 實驗藥物 補腎活血方藥物組成：熟地黃24 g，巴戟天 9 g，續(xù)斷 9 g，桑寄生 9 g，龜板 15 g，黃芪 15 g，白術(shù) 9 g，大棗 9 g，丹參 12 g，當(dāng)歸 12 g，杜仲 9 g，甘草3 g。常規(guī)水煎制，含藥量為0.912 g／mL。戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司），使用時將藥片研磨后用超純水配成濃度為0.016 mg／mL。

1.3 實驗試劑 兔抗大鼠Smurf1一抗（美國Invitrogen公司，Cat：387900）；HRP 羊抗兔二抗（美國Jackson公司）；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（美國Thermo Fisher公司）；水合氯醛注射液（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；TKaRa RNAPCR Kit（AMV）Ver.3.0 試劑盒、DNA Marker DL2000（TaKaRa大連寶生物公司）；Smurf1引物（由TaKaRa大連寶生物公司合成）；甲醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；無水乙醇（分析純，山東利爾康消毒科技有限公司）。

1.4 實驗儀器 Milli-pore超純水系統(tǒng)（德國Millipore公司）；Thermo超低溫冰箱（美國Thermo公司）；蔡司Axio Observer倒置熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；Fluor Chem R多功能成像分析系統(tǒng)（美國Protein Simple公司）。

2 實驗方法

2.1 造模和分組 先將64只大鼠隨機分正常組12只、假手術(shù)組12只及造模組40只。除正常組外，其余大鼠用10%水合氯醛（0.25 mL／100 g）腹腔注射麻醉。麻醉后，于大鼠最末肋骨下，從腋中線和距腰背部脊柱外側(cè)1 cm作縱行切口，逐層切開皮膚及肌肉，結(jié)扎輸卵管，將卵巢完整摘除，同法切除另一側(cè)卵巢。兩側(cè)卵巢組織切除后，逐層縫合并關(guān)閉創(chuàng)口。而假手術(shù)組只行切口切開，但并不切除卵巢組織，僅切除卵巢周圍少許的脂肪組織，隨后逐層縫合。術(shù)后3個月，造模組死亡4只，將造模組按體質(zhì)量隨機分為空白模型組、戊酸雌二醇組和補腎活血方組，每組各12只。

2.2 干預(yù) 補腎活血方組按9.12 mg／（kg·d）予補腎活血方水煎液灌胃，戊酸雌二醇組按 0.16 mg／（kg·d）予戊酸雌二醇藥液灌胃，正常組、假手術(shù)組、空白模型組予等體積純凈水灌胃。每日上午灌胃1次，連續(xù)灌胃6 d，休息1 d后，再繼續(xù)灌胃，連續(xù)干預(yù)12周。實驗期間，各組大鼠每周進行稱重1次，并根據(jù)體質(zhì)量變化每周調(diào)整給藥劑量。實驗大鼠在最后一次給藥后，予以禁食24 h，麻醉后對手術(shù)部位進行消毒，并采集標(biāo)本。

2.3 Smurf1 mRNA在大鼠腎組織中的RT-PCR檢測 取一側(cè)腎皮質(zhì)約50～100 g，將其放入裝有1 mL TRIzol的Ep管內(nèi)，按照說明書提取總RNA。根據(jù)大鼠Smurf1 cDNA序列，設(shè)計合成了擴增Smurf1 cDNA片段的特異性引物。Smurf1：上游5’-GTTGAG CGAGCAAGTGA-3’，下游 5’-TGGGAGGAAAGGC ATC-3’，擴增的基因片段長度為377 bp。

2.4 Smurf1在腎組織中的Western blot檢測 取大鼠的腎組織塊250 mg，將其在液氮中碾成粉末，并加入1 mL已經(jīng)預(yù)冷的組織裂解液，用勻漿機于冰浴中勻漿2 min后，在4℃下14 000 r／min，離心1 h，取上清液并于4℃保存?zhèn)溆?。進行總蛋白的定量、SDS-PAGE電泳、蛋白的轉(zhuǎn)膜以及膜的封閉，最后通過ECL試劑盒進行化學(xué)發(fā)光顯色。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 5組大鼠腎臟組織Smurf1 mRNA表達比較見圖1。

圖1 5組大鼠腎臟組織Smurf1凝膠電泳圖

3.2 5組大鼠腎臟組織Smurf1蛋白表達比較 見圖 2、圖 3。

4 討 論

圖2 5組大鼠腎臟組織smurf1蛋白電泳圖

圖3 5組大鼠腎臟組織Smurf1蛋白灰度值比較

根據(jù)骨質(zhì)疏松的特點，應(yīng)屬祖國醫(yī)學(xué)中的“骨枯”“骨痿”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎主骨、藏精、生髓，為先天之本，早在黃帝內(nèi)經(jīng)《素問·痿論》中記載：“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”，《黃帝內(nèi)經(jīng)》指出：“骨不生，則髓不能滿”“骨者，髓之府，不能久立，行則振掉，骨將憊矣”均闡述了腎與骨、髓之間的聯(lián)系。腎精充足，則骨有生氣，相反，若腎精腎氣不足，則諸骨皆枯，導(dǎo)致全身的骨量降低，易發(fā)生骨折及疼痛。因此，腎虛當(dāng)為骨質(zhì)疏松重要的一個病因。清代醫(yī)學(xué)家王清任在《醫(yī)林改錯》提出：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而為瘀”，血瘀則是發(fā)病機理中的必然產(chǎn)物?；诖耍鶕?jù)“腎虛血瘀”的理論，治療上采用標(biāo)本兼治為法則，補腎為主，輔以活血化瘀。

補腎活血方中熟地黃、龜板滋陰益髓、養(yǎng)血補精，為君藥；巴戟天、續(xù)斷、桑寄生、杜仲補益肝腎，強筋健骨，祛風(fēng)除濕，為臣藥；丹參、當(dāng)歸活血補血，黃芪、白術(shù)益氣健脾，共為佐藥；大棗、甘草益氣補血，緩急止痛，調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏補腎活血、填精益髓之效。

骨代謝的過程包括骨吸收和骨形成，其過程受到許多生長因子、轉(zhuǎn)錄因子以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等的調(diào)節(jié)。其中TGF超家族中的轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）對骨細(xì)胞的增殖、分化與凋亡起著重要作用［5］，其不僅能夠刺激骨細(xì)胞的DNA表達與重組、膠原的合成，對多種細(xì)胞活性與促細(xì)胞生長起作用，同時還可抑制破骨細(xì)胞的生成以及成熟破骨細(xì)胞的活性，進而抑制骨吸收。因此，可通過研究UPP調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)化生長因子和其信號通路，來進一步研究骨質(zhì)疏松癥的內(nèi)在機制。

Smad通路是目前公認(rèn)的可介導(dǎo)TGF超家族細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的主要通路。TGF-β／Smad通路是介導(dǎo)TGF超家族的細(xì)胞外信號跨膜傳遞到細(xì)胞核內(nèi)的重要通路。1999年，隨著降解R-Smads的泛素連接酶的被發(fā)現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)了泛素-蛋白水解酶復(fù)合體通路可以調(diào)控Smads的降解，進而證明了Smad通路的關(guān)閉與調(diào)節(jié)可通UPP來實現(xiàn)［6］。由于TGF-β／Smad通路對于骨代謝過程具有重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)作用，而UPP又可調(diào)節(jié)TGF-β／Smad通路，因此UPP對于TGF-β／Smad通路的異常介導(dǎo)可影響骨的代謝，所以本實驗以UPP中的泛素連接酶Smurf1為主要研究對象。

本研究結(jié)果顯示，正常雌性大鼠的腎臟中可表達Smurf1，切除卵巢后，體內(nèi)雌激素分泌可明顯降低，使得TGF-β／Smad信號通路的降解出現(xiàn)了異常，最終導(dǎo)致了骨代謝異常及骨質(zhì)疏松癥的出現(xiàn)。當(dāng)給予補腎活血方制劑及戊酸雌二醇后，腎臟組織中的Smurf1蛋白的表達量均有顯著的上升。因此，補腎活血方具有改善Smurf1蛋白表達的作用，從而具有治療骨質(zhì)疏松的作用。雖然Smurf1是蛋白質(zhì)降解的重要因素，但其機理目前還不十分清楚。同時，機體是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，各種因子對于骨代謝調(diào)節(jié)的相互關(guān)系又十分復(fù)雜，因此，Smurf1對于骨代謝相關(guān)因子的調(diào)節(jié)仍需進一步的研究。