糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)性與三氯乙烯藥疹樣皮炎的關(guān)系探討

池 毅， 李 輝， 畢 靜

(深圳市職業(yè)病防治院皮膚性病科， 深圳 518001)

三氯乙烯是常用的工業(yè)原料，在金屬脫脂、化工原料、醫(yī)藥中間體生產(chǎn)和農(nóng)藥生產(chǎn)等行業(yè)中均為重要的基礎(chǔ)物質(zhì)。三氯乙烯長(zhǎng)期接觸可導(dǎo)致嚴(yán)重的中毒事件，以三氯乙烯藥疹樣皮炎較為常見(jiàn)[1]。三氯乙烯藥疹樣皮炎多為職業(yè)原因所致，可出現(xiàn)全身性彌漫性暗紅色腫脹、剝脫性皮炎、表皮壞死松解癥等，常伴有眼、口、會(huì)陰部黏膜損害，甚至?xí)?dǎo)致內(nèi)臟或神經(jīng)系統(tǒng)損害，已成為人們重點(diǎn)關(guān)注的職業(yè)性疾病[2]。有研究報(bào)道，糖皮質(zhì)激素受體(GR)對(duì)糖皮質(zhì)激素藥物的敏感性直接影響三氯乙烯藥疹樣皮炎的療效及預(yù)后，且GR基因多態(tài)性與皮膚、黏膜變應(yīng)性疾病的發(fā)生均存在緊密關(guān)系[3]，其中R477H、G679S位點(diǎn)是研究的熱點(diǎn)。本研究旨在探討GR基因多態(tài)性與三氯乙烯藥疹樣皮炎的關(guān)系，并分析后者的危險(xiǎn)因素，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料對(duì)2012年1月-2018年10月深圳市職業(yè)病防治院收治的350例有三氯乙烯接觸史的受檢者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，其中有60例發(fā)生三氯乙烯藥疹樣皮炎，作為發(fā)生組，余290例作為未發(fā)生組。350例受檢者中，男性286例，女性64例，年齡24～56歲，平均年齡(35.86±5.97)歲；三氯乙烯接觸時(shí)長(zhǎng)1周至13年，平均(4.52±1.08)年；行業(yè)：金屬脫脂122例，化工原料85例，醫(yī)藥中間體生產(chǎn)65例，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)46例，其他32例。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：均有三氯乙烯接觸史，發(fā)生組均符合《職業(yè)病診斷與鑒定管理辦法》診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]且為初診患者，所有受檢者均接受GR基因R477H、G679S位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，均有完整的臨床資料,且患者本人均同意對(duì)其研究資料進(jìn)行回顧性分析。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在或合并其他原因?qū)е碌乃幷顦悠ぱ渍?，如失禁相關(guān)性皮炎、糖皮質(zhì)激素依賴性皮炎、甲醛接觸所致變應(yīng)性接觸性皮炎等，合并其他類型系統(tǒng)性疾病或臟器功能損傷者，存在先天性發(fā)育異?；蚬δ苷系K者，合并免疫缺陷者，存在溝通障礙者。

1.3 方法

1.3.1 試劑及儀器 真空采血抗凝管購(gòu)自山東天愛(ài)醫(yī)療器械有限公司；全血基因組DNA快速提取試劑盒購(gòu)自杭州昊鑫生物科技有限公司；甲酰胺、GeneScanTM120LIZ○RSize Standard、Snapshot Multiplex Kit購(gòu)自美國(guó)ABI公司；引物委托上海生工科技有限公司合成；TP-96G型PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自浙江托普儀器有限公司；3130XL型測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)ABI。

1.3.2 DNA提取 所有受檢者均于清晨空腹抽取肘靜脈血，每位受試者抽取5 mL，置于真空采血抗凝管中，靜置并將其放置于冰盒中，2 h內(nèi)送至檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測(cè)。將待檢測(cè)樣本進(jìn)行離心分離，取血漿并采用溶液型全血基因組DNA快速提取試劑盒對(duì)基因組的DNA進(jìn)行提取。

1.3.3 GR基因R477H、G679S位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性檢測(cè) 利用Snapshot多重單堿基延伸反應(yīng)對(duì)等位基因進(jìn)行檢測(cè)，以Primer3軟件在線設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物，其中R477H位點(diǎn)引物：上游：TTCGCTAGCTAGCTCCTAGCTA；下游：TCTATCCTGGCTCTGCACTAGA；G679S位點(diǎn)引物：上游：TCGCTTTAAGCGCTTAGACTCC；下游：TTAGTTAGTCCCCTAGCTGCCA，引物長(zhǎng)度均為248 bp。以PCR擴(kuò)增儀實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系：(1)Snapshot多重單堿基延伸反應(yīng)：①延伸反應(yīng)體系，共10 μL(其中Snapshot Multiplex Kit 5 μL+純化后多重PCR產(chǎn)物2 μL+超純水2 μL+延伸引物混合物1 μL)，循環(huán)條件：96℃持續(xù)1 min，(96℃持續(xù)10 s，50℃持續(xù)5 s，60℃持續(xù)30 s)×28，60℃持續(xù)1 min，4℃終止反應(yīng)；(2)延伸產(chǎn)物檢測(cè)：以測(cè)序儀純化處理，取0.5 μL延伸產(chǎn)物，與甲酰胺9 μL+GeneScanTM120LIZ?Size Standard 0.5 μL與產(chǎn)物混合均勻，95℃變性5 min，以測(cè)序儀檢測(cè)；在測(cè)序儀上收集原始數(shù)據(jù)，并利用GeneMapper 4.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.4 藥疹樣皮炎危險(xiǎn)因素分析 總結(jié)可能影響藥疹樣皮炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素[5-6]，包括性別、年齡、行業(yè)、三氯乙烯接觸時(shí)長(zhǎng)、接觸方式、GR基因R477H、G679S位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性等，將其作為自變量，將三氯乙烯藥疹樣皮炎是否發(fā)生作為因變量，進(jìn)行危險(xiǎn)因素分析，其中自變量賦值結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 自變量賦值結(jié)果

1.4 觀察指標(biāo)(1)對(duì)比發(fā)生組和未發(fā)生組GR基因R477H、G679S位點(diǎn)基因型分布；(2)對(duì)比發(fā)生組和未發(fā)生組可能影響因素的構(gòu)成比差異；(3)明確影響三氯乙烯藥疹樣皮炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素，統(tǒng)計(jì)其比值比(OR)，并探討GR基因R477H、G679S位點(diǎn)等位基因與該病發(fā)生的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以“n/%”描述計(jì)數(shù)資料，組間對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)，若理論頻數(shù)為1～5，則需校正；危險(xiǎn)因素分析采用Logistic回歸。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組GR基因R477H、G679S位點(diǎn)基因型分布比較發(fā)生組GR基因R477H位點(diǎn)、G679S位點(diǎn)CC基因型構(gòu)成比與未發(fā)生組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，發(fā)生組上述位點(diǎn)CG基因型構(gòu)成比均低于未發(fā)生組(P<0.05)，GG基因型構(gòu)成比均高于未發(fā)生組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 2組GR基因R477H、G679S位點(diǎn)基因型分布對(duì)比(n/%)

2.2 2組可能影響因素的構(gòu)成比比較發(fā)生組年齡>50歲、三氯乙烯接觸時(shí)長(zhǎng)>3年、直接接觸構(gòu)成比均高于未發(fā)生組(P<0.05)，且發(fā)生組GR基因R477H、G679S位點(diǎn)等位基因頻率均高于未發(fā)生組(P<0.05)，2組性別、行業(yè)構(gòu)成比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

2.3 三氯乙烯藥疹樣皮炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析年齡>50歲、三氯乙烯接觸時(shí)長(zhǎng)>3年、直接接觸、GR基因R477H、G679S位點(diǎn)G等位基因均是三氯乙烯藥疹樣皮炎的危險(xiǎn)因素(OR=5.966、5.129、7.221、4.272、7.121，P<0.05)，見(jiàn)表4。

表3 2組可能影響因素的構(gòu)成比對(duì)比(n/%)

3 討論

國(guó)際癌癥研究署于1995年將三氯乙烯分類為“人類可能致癌”，可知三氯乙烯接觸可對(duì)人們的健康造成極大的威脅。除此之外，三氯乙烯藥疹性皮炎也是嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康的重要問(wèn)題，對(duì)患者的身心健康、生活質(zhì)量及家庭經(jīng)濟(jì)狀況均可造成極大的打擊[7-8]。但是目前關(guān)于三氯乙烯藥疹性皮炎的發(fā)生機(jī)制認(rèn)識(shí)尚淺。有研究報(bào)道，三氯乙烯藥疹樣皮炎的易感性與腫瘤壞死因子-α、代謝酶、白細(xì)胞介素-4等基因多態(tài)性均具有密切關(guān)系[9]，可知某些基因位點(diǎn)的單核苷酸突變可能會(huì)增加三氯乙烯藥疹樣皮炎的易感性，而唯有深入了解其發(fā)生機(jī)制才能制定有針對(duì)性的防治措施。

本研究結(jié)果顯示，發(fā)生組GR基因R477H位點(diǎn)、G679S位點(diǎn)CG基因型構(gòu)成比均低于未發(fā)生組(P<0.05)，GG基因型構(gòu)成比均高于未發(fā)生組(P<0.05)，且發(fā)生組上述位點(diǎn)G等位基因頻率均明顯高于未發(fā)生組(P<0.05)，經(jīng)Logistic回歸分析證實(shí)其均為三氯乙烯藥疹性皮炎發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可知GR基因R477H位點(diǎn)、G679S位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率與該病的發(fā)生均存在緊密關(guān)系，且G等位基因頻率可增加該病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。GR基因在多種皮膚、黏膜反應(yīng)性疾病中均被證實(shí)發(fā)揮重要的作用。GR屬于一種核激素受體蛋白超家族，具有轉(zhuǎn)錄活化調(diào)控基因表達(dá)的功能，在生物體中分布較為廣泛，主要以可溶性結(jié)合蛋白形式存在于細(xì)胞液中[10-12]。以往有報(bào)道顯示，GR基因R477H位點(diǎn)、G679S位點(diǎn)、rs41423247位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布與機(jī)體正常生理代謝均存在密切的關(guān)系[13]。Hu等[14]研究報(bào)道，三氯乙烯藥疹樣皮炎是易感性和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，當(dāng)機(jī)體受到三氯乙烯刺激后，體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)活性增加，可促使腎上腺分泌大量的糖皮質(zhì)激素，而糖皮質(zhì)激素的合成則與GR的代謝緊密相關(guān)；另一方面，糖皮質(zhì)激素的生成可動(dòng)員機(jī)體適應(yīng)環(huán)境，而部分反應(yīng)嚴(yán)重者可引起免疫活化，過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答可損傷局部皮膚和黏膜，從而誘發(fā)三氯乙烯藥疹樣皮炎[15]。據(jù)此可以推測(cè)，GR基因R477H位點(diǎn)和G679S位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率異常均可能是通過(guò)上述途徑誘發(fā)三氯乙烯藥疹樣皮炎，但具體機(jī)制仍需要深入研究。

表4 三氯乙烯藥疹樣皮炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析

本研究還發(fā)現(xiàn)，年齡>50歲、三氯乙烯接觸時(shí)長(zhǎng)>3年、直接接觸均是三氯乙烯藥疹樣皮炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素，可知上述因素均可增加三氯乙烯藥疹樣皮炎的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。華明等[16]研究指出，年齡>50歲是三氯乙烯藥疹樣皮炎患者死亡的危險(xiǎn)因素。年齡>50歲、三氯乙烯接觸時(shí)長(zhǎng)>3年、直接接觸均可增加三氯乙烯藥疹樣皮炎發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，分析原因可能是由于年齡>50歲的職工由于長(zhǎng)期勞累大多身體素質(zhì)較差，機(jī)體自我調(diào)節(jié)和適應(yīng)能力不佳，對(duì)三氯乙烯產(chǎn)生的刺激反應(yīng)大，容易發(fā)生三氯乙烯藥疹樣皮炎；三氯乙烯接觸時(shí)長(zhǎng)>3年者由于長(zhǎng)期接觸可增加皮膚、黏膜暴露的風(fēng)險(xiǎn)，從而增加該病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；直接接觸可加重對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的刺激性損傷，機(jī)體反應(yīng)加重，三氯乙烯藥疹性皮炎的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高。

綜上，在三氯乙烯藥疹性皮炎患者中，GR基因R477H位點(diǎn)、G679S位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率均存在明顯差異，且二者G等位基因頻率均可增加該病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，年齡>50歲、三氯乙烯接觸時(shí)長(zhǎng)>3年、直接接觸均為該病的危險(xiǎn)因素，需針對(duì)存在上述危險(xiǎn)因素者加強(qiáng)防控，一旦發(fā)生該病則應(yīng)及時(shí)診治，并將此類患者作為重點(diǎn)監(jiān)控對(duì)象，以改善預(yù)后。