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    鹿茸補骨片對增加骨密度功能的試驗研究

    2019-06-22 05:38:32孫敬蒙
    關(guān)鍵詞:骨鈣鹿茸去離子水

    王 丹,孫敬蒙

    (1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,長春 130117;2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院藥學(xué)部,長春 130021)

    隨著我國人口老齡化程度的加劇,骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率也隨之升高[1-2],其最大的危害是骨質(zhì)疏松性骨折,且前臂遠(yuǎn)端骨折一直被認(rèn)為是典型的骨質(zhì)疏松性骨折[3-5]。骨密度作為骨質(zhì)疏松癥的預(yù)測指標(biāo)[6-8],其保健食品的開發(fā)引起了醫(yī)藥工作者的高度關(guān)注,鹿茸補骨片主要采用吉林省道地藥材馬鹿茸與黃芪配伍為君藥[9],《本草綱目》記載[10],鹿茸能夠起到養(yǎng)血益陽,強筋健骨,治一切虛損、耳聾、目暗、眩暈虛痢作用[11-12]。為進一步證實鹿茸補骨片增加骨密度的功能,本研究綜合分析了其對骨密度及骨鈣含量等指標(biāo)的影響,并對鹿茸補骨片進行急性經(jīng)口毒性試驗,初步對原料毒性特性進行評估,本文研究內(nèi)容可為鹿茸補骨片保健食品的研發(fā)及增加骨密度機理研究提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

    1 材料

    1.1 試驗動物與條件 SPF 級SD 大鼠和SPF 級ICR小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司,實驗動物許可證號:SCXK(遼)2015-0001,在SPF級動物實驗中心(屏障環(huán)境)飼養(yǎng)(許可證號:SYXK(黑)2011007),溫度為21 ~23 ℃,濕度為55%~58%。試驗動物所用的清潔級飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司(許可證號:SCXK(京)2014-0010)。

    1.2 樣品 鹿茸補骨片,由哈爾濱久盛醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司,以馬鹿茸、黃芪、骨碎補、熟地黃為原料,樣品為異形片劑,0.53 g/片(約每片含生藥馬鹿茸0.24 g,黃芪0.78 g,骨碎補0.52 g,熟地黃0.78 g),推薦成人(60 kg 計)用量為2 片/次,2 次/d。

    1.3 儀器與試劑 雙能X 線骨密度儀(上海伊沐醫(yī)療器械有限公司)、原子吸收分光光度計(北京達(dá)豐瑞儀器儀表有限公司)、電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、精密卡尺(東莞市三本精密儀器源頭廠)、動物解剖器械、灌胃針、注射器等均購自吉林省金泰化玻有限公司;主要試劑如硝酸、高氯酸為優(yōu)級純,氧化鑭、碳酸鈣及鹽酸等均為分析純由吉林省金泰化玻有限公司公司。

    1.4 劑量設(shè)計 樣品推薦用量為2 次/d,2 片/次,0.53 g/片,因此每人2.12 g/d。成人體質(zhì)量以60 kg 計,則樣品用量相當(dāng)于0.035 g/ kg·bw。以人體推薦量的5 倍,即每日0.175 g/kg·bw 為低劑量,另設(shè)2 個劑量組:0.35 g/kg·bw (人體推薦量的10 倍為中劑量)和1.05 g/kg·bw (人體推薦量的30 倍為高劑量)。同時設(shè)空白對照組(灌胃去離子水),以及假手術(shù)+去離子水組和卵巢切除+去離子水組。

    2 功能性試驗

    2.1 試驗方案 雌性SD 大鼠50 只,適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后隨機分成5組,每組10 只。去勢手術(shù)安排:假手術(shù)+去離子水組,鼠經(jīng)腹腔注射30 mg/kg·bw 的戊巴比妥鈉溶液麻醉,在嚴(yán)格無菌操作下,腹位固定后于腹中線距陰道口3 ~4 cm 處去毛,分別用碘酒和酒精消毒,待稍干后切開皮膚和腹肌約2 ~3 cm,腹肌和皮膚分層縫合后,再次消毒。最后經(jīng)后肢肌肉注射2 萬U 青霉素;卵巢切除組+去離子水組和雷允上牌固葆片三個劑量組,麻醉方法同上,在嚴(yán)格無菌操作下,腹位固定后于腹中線距陰道口3 ~4 cm 處去毛,分別用碘酒和酒精消毒,待稍干后切開皮膚和腹肌約2 ~3 cm,切口視野可見白色脂肪,撥開脂肪層找到子宮后,輕輕將一側(cè)子宮角拉出,在其末端可見被脂肪團包裹的卵巢。分離脂肪團,便可見粉紅色或黃紅色的卵巢,以止血鉗夾住卵巢,然后將卵巢下輸卵管(包括脂肪)用絲線結(jié)扎,剪除卵巢(檢查是否完全剪除),順勢將子宮角送回腹腔中,同法剪除另側(cè)卵巢,腹肌和皮膚分層縫合后,再次消毒。最后經(jīng)后肢肌肉注射2 萬U青霉素。為保證手術(shù)成功,大鼠摘除卵巢后5 d,進行陰道涂片檢查(用滴管吸取少量生理鹽水,輕輕插入陰道1 ~2 cm,沖洗數(shù)次后吸出,涂于玻片上,鏡下觀察),1 次/d,連續(xù)7 d,以檢查大鼠卵巢是否完全摘除;如涂片呈動情反應(yīng)(鏡下見大量半透明、扁平的表皮細(xì)胞),表明動物卵巢切除不完全,應(yīng)棄去不用[13-14]。

    切除大鼠雙側(cè)卵巢7 d 后,按照1.4 劑量設(shè)計,卵巢切除三個劑量組(灌胃液的配制:分別取鹿茸補骨片1.75 g,3.5 g,10.5 g,加去離子水定容至100 mL,配制成0.175 g/kg·bw,0.35 g/kg·bw,1.05 g/kg·bw的灌胃液);經(jīng)口給予假手術(shù)+去離子水組和卵巢切除+去離子水組動物等容積的去離子水。所有動物灌胃劑量均為10 mL/kg·bw,1 次/d,連續(xù)灌胃90 d,每周稱體質(zhì)量并按體質(zhì)量調(diào)整灌胃量。

    2.2 骨密度測定 將待測股骨放置測量臺上,與骨密度儀探測頭移動方向垂直,移動待測股骨,令其待測點標(biāo)記線與探測頭移動軌跡與測量臺上的垂直投影重合。開始測量,每個點測量2 次,2 次測量誤差不大于10%。將2 次結(jié)果取平均值[15-16]。

    2.3 骨鈣含量測定 取大鼠一側(cè)股骨,在105 ℃烘箱中烘干至恒重后,精密稱重和精密測量長度,記錄數(shù)值。將股骨研成粉末,精密稱取適量(0.300 ~1.000 g),置于150 mL 三角瓶中,上蓋小漏斗,加入混酸(硝酸:高氯酸= 4:1)15 ~20 mL,在電熱板上加熱消化直至冒白煙并透明無色。消化液透明無色后加入少量去離子水,煮沸,除去剩余的酸,重復(fù)2 次,最后消化液體積不超過1 mL??瞻讓φ諡橄嗤w積的混酸,按照樣品處理相同方法消化制得。以原子吸收法測定骨鈣含量[17]。

    2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)分析。先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算F值,F(xiàn)<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計;對非正態(tài)或是方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或是方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若是變量轉(zhuǎn)換后仍未到達(dá)正態(tài)或是方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。

    2.5 結(jié)果判定 本產(chǎn)品屬不含鈣的產(chǎn)品,卵巢切除+去離子水組(模型對照組)骨鈣含量或骨密度顯著低于假手術(shù)組(空白對照組),表明造成大鼠骨密度低下模型;卵巢切除+受試物組的骨鈣含量和骨密度較卵巢切除+去離子水組顯著增加,而其他指標(biāo)(體質(zhì)量除外)不顯著低于卵巢切除+去離子水組,可判定受試物具有增加骨密度功能作用。

    3 急性經(jīng)口毒性試驗

    選用SD 大鼠和ICR 小鼠各20 只,雌雄各半,體質(zhì)量分別為180 ~220 g 和18 ~22 g。大、小鼠購買后在本實驗室適應(yīng)環(huán)境5 d,采用最大耐受量試驗方法,禁食16 h后24 h內(nèi)經(jīng)口灌胃二次[18]。取鹿茸補骨片50 g,溶于去離子水中并定容至100 mL 大、小鼠的灌胃容積均為20 mL/kg·bw,灌胃劑量均為20.0 g/kg·bw(相當(dāng)于推薦劑量的666.7 倍)。觀察大、小鼠的中毒表現(xiàn)和死亡時間,觀察時間為14 d。

    4 結(jié)果

    4.1 受試樣品對大鼠體質(zhì)量的影響 由表1可見,初始體質(zhì)量、給樣前(去勢手術(shù)后)各組體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05);實驗從第1 周開始卵巢切除+去離子水組體質(zhì)量顯著高于假手術(shù)+去離子水組(第1 周P<0.05,第2 周以后P<0.01),90 d喂養(yǎng)中給予受試物各劑量組體質(zhì)量顯著高于假手術(shù)+去離子水組(P<0.01),而與卵巢切除+去離子水組無顯著性差異(P>0.05)。

    表1 受試樣品對大鼠體質(zhì)量的影響(n = 10) g

    4.2 鹿茸補骨片對骨鈣含量的影響 由表2可見,給予受試物90 d 后,卵巢切除+去離子水組骨鈣含量和總鈣量顯著低于假手術(shù)+去離子水組(P<0.01),各組與卵巢切除+去離子水組相比,股骨重量略低,但沒有顯著性差異(P>0.05),造模成功;受試物組骨鈣含量和總鈣量有不同程度增高,其中,中、高劑量組(即卵巢切除+ 0.35組和卵巢切除+1.05組)骨鈣含量和總鈣量均顯著高于卵巢切除+去離子水組(P<0.01)。

    表2 去卵巢大鼠股骨重量和骨鈣含量變化(n = 10)

    4.3 鹿茸補骨片對大鼠骨密度的影響 由表3可見,給予受試物90 d 后,卵巢切除+去離子水組骨密度顯著低于假手術(shù)+去離子水組(P<0.01),中、高劑量組股骨中心骨密度和股骨遠(yuǎn)心端骨密度均顯著高于卵巢切除+去離子水組(P<0.01)。

    4.4 急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果 見表4、5、6。

    5 討論

    鹿茸補骨片由四味中藥配伍,相得益彰,共奏補血填精,固腎健骨之功效[19-20],適用于骨痿(骨質(zhì)疏松)以五臟虛衰,腎枯髓竭證,以周身骨痛,腰背酸軟疼痛,常易抽筋、多汗,下肢痿軟無力,不能持重為主要臨床表現(xiàn)者[21-22]。綜合試驗結(jié)果分析可知,給予鹿茸補骨片90 d 后,中、高劑量組均能顯著提高去卵巢大鼠骨密度,低、中、高劑量組均能顯著提高去卵巢大鼠骨鈣含量,其他指標(biāo)如體質(zhì)量、股骨長度、股骨重量等均不顯著低于模型組。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》2003年版判定標(biāo)準(zhǔn),判定鹿茸補骨片具有增加骨密度功能作用。在14 d的觀察期間內(nèi),兩性別大、小鼠一般狀態(tài)良好,未出現(xiàn)任何中毒癥狀,無動物死亡。根據(jù)試驗所設(shè)計的劑量,觀察到的結(jié)果及大、小鼠急性毒性判定標(biāo)準(zhǔn),可以認(rèn)為鹿茸補骨片大、小鼠經(jīng)口最大耐受量大于20.0 g/kg·bw,且屬無毒級,也可作為其他毒理學(xué)試驗劑量的依據(jù)。

    表3 受試樣品對大鼠股骨長度和骨密度的影響(± s,n = 10) g/cm2

    表3 受試樣品對大鼠股骨長度和骨密度的影響(± s,n = 10) g/cm2

    注:與假手術(shù)+去離子水組比較,## P <0.01;與卵巢切除+去離子水組比較,△△P <0.01

    股骨遠(yuǎn)心端骨密度(g/cm2)假手術(shù)+去離子水 0.210±0.012△△ 0.254±0.030△△卵巢切除+去離子水 0.189±0.020## 0.200±0.018##卵巢切除+ 0.175 g/kg·bw 0.203±0.012 0.214±0.020##卵巢切除+ 0.35 g/kg·bw 0.209±0.016△△ 0.218±0.019##△△卵巢切除+ 1.05 g/kg·bw 0.215±0.018** 0.226±0.029##**組 別 股骨中心骨密度(g/cm2)

    表4 鹿茸補骨片大、小鼠急性經(jīng)口毒性試驗體質(zhì)量(± s ,n = 10) g

    表4 鹿茸補骨片大、小鼠急性經(jīng)口毒性試驗體質(zhì)量(± s ,n = 10) g

    動物 性別 劑量/(g/kg·bw) 初始體質(zhì)量 1 周末體質(zhì)量 2 周末體質(zhì)量小鼠 雄 20.0 20.3±1.4 25.8±1.4 30.3±2.6雌20.0 images/BZ_125_794_1287_798_1287.png 20.2±1.3 25.0±1.5 29.0±1.4大鼠 雄 20.0 201.4±11.2 241.4±7.7 293.0±8.8雌20.0 199.8±14.1 235.1±6.0 280.5±8.8

    表5 鹿茸補骨片大鼠急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果(n = 10) g/kg·bw

    表6 鹿茸補骨片小鼠急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果(n = 10) g/kg·bw

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