LC3B和mTOR在口腔黏膜白斑和口腔鱗癌組織中的表達(dá)

董小琳 柳志文

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是口腔中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，威脅著人們的健康和生命[1]。而口腔黏膜白斑(oral leukoplakia,OLK)為最常見(jiàn)的癌前病變，研究顯示，OSCC 中約有 17%～35%是由OLK發(fā)展而來(lái)[2]。早期診斷治療OLK惡變對(duì)預(yù)防OSCC發(fā)生有積極作用。目前已有相當(dāng)研究證明自噬可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞死亡而導(dǎo)致癌變，近年來(lái)由于其在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中的顯著作用，尤其是在癌癥的發(fā)病機(jī)制及治療中的作用而備受關(guān)注[3]。微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3，LC3)是自噬體膜在形成過(guò)程中必不可少的基因，其模型LC3B的含量與自噬發(fā)生程度呈正相關(guān)，由于其特殊性自噬體及以往在OSCC中表達(dá)被選定為研究對(duì)象[4],用于衡量自噬活性[5]，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR) 在自噬通路中作為逆向調(diào)控者，是負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的核心基因。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)上述自噬關(guān)鍵基因在OLK和OSCC中的表達(dá)，探討其與OLK癌變的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2016-12～2017-11湖南省長(zhǎng)沙市湘雅口腔醫(yī)院病理科蠟塊，包括OLK組織120 例和OSCC組織30 例。OLK組織根據(jù)組織病理學(xué)改變劃分為“單純?cè)錾?30 例)和“異常增生”(90 例)，“異常增生”根據(jù)其程度劃分為“輕度異?！?、“中度異?！焙汀爸囟犬惓！?，各30 例，并收集其臨床資料，包括患者年齡、性別、發(fā)病部位、是否吸煙及臨床分型。另收集手術(shù)切除的正常黏膜20 例，常規(guī)石蠟包埋。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行激素、化療、放療，且無(wú)自身系統(tǒng)性疾病。研究對(duì)象均簽署知情同意書并納入研究，本試驗(yàn)獲得中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑 兔抗人LC3B(ab48394， 1∶300)、 mTOR(ab32028， 1∶400)抗體(Abcam公司， 美國(guó))； 免疫組化Super Vision試劑盒(SV0002， 武漢博士德生物技術(shù)有限公司)； DAB顯色劑盒(NA， 北京嘉美生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化法檢測(cè)LC3B和mTOR的表達(dá) 將石蠟標(biāo)本3 μm 連續(xù)切片，烘干，脫蠟、至水，枸櫞酸微波抗原修復(fù)， 3% H2O2常溫孵育30 min，避免內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性干擾;磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗， 5% BSA 封閉，加一抗， 4 ℃過(guò)夜，復(fù)溫后PBS沖洗，滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG 37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染， 1%鹽酸乙醇分化，脫水，透明，封片。用已知的陽(yáng)性照片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定 兩人雙盲閱片，隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察(× 400)，根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分及陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，結(jié)果取平均值。LC3B 和 mTOR 均以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。A：染色強(qiáng)度分為： 0(無(wú)染色)， 1(淡黃色)， 2(黃色)， 3(棕黃色)； B：陽(yáng)性細(xì)胞的比例評(píng)分：1(0～10%)， 2(10%～50%)， 3(50%～100%)。最后評(píng)分為：A×B。 1～3 分為陰性，記(-)，≥4 分為陽(yáng)性，其中4～5 分記(+)，6～8 分記(++)，9 分及以上記(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。LC3B、mTOR在組織中的表達(dá)強(qiáng)度比較采用秩和檢驗(yàn)，其余計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性通過(guò)Spearman相關(guān)性分析實(shí)現(xiàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LC3B在不同組織中表達(dá)

LC3B的表達(dá)主要見(jiàn)于上皮基底層、棘層、顆粒層及固有層淺層的細(xì)胞，其染色部位主要定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核(圖 1)，在正常口腔黏膜、OLK及OSCC組織中的陽(yáng)性率分別為85.0%(17/20)、65.8%(79/120)和33.3%(10/30),結(jié)果有顯著性差異(P<0.01，表 1)。在OLK各病理分型中，LC3B表達(dá)率分別為單純性增生83.3%(25/30)、輕度異常73.3%(22/30)、中度異常56.7%(17/30)、重度異常50.0%(15/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05， 表 1)。

圖 1 LC3B在各組中的表達(dá)

2.2 mTOR在不同組織中表達(dá)

mTOR的表達(dá)主要見(jiàn)于上皮全層，少數(shù)見(jiàn)于固有層及結(jié)締組織淺層細(xì)胞，陽(yáng)性表達(dá)均位于細(xì)胞質(zhì)(圖 2)，在正?？谇火つぁLK及OSCC組織中的陽(yáng)性率分別為20.0%(4/20)、48.3%(58/120)和76.7%(23/30)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01， 表 1)。而在OLK組織內(nèi)，mTOR表達(dá)率分別為單純性增生36.7%(11/30)、輕度異常40.0%(12/30)、中度異常53.3%(16/30)、重度異常63.3%(19/30),但差異不具有顯著性(P>0.05， 表 1)。

2.3 LC3B和mTOR在組織中表達(dá)的相關(guān)性

雙變量相關(guān)分析, LC3B陽(yáng)性率的逐漸下降與組織惡性度顯著負(fù)相關(guān)(r=-1.000，P<0.01)， mTOR 陽(yáng)性率的逐漸升高與組織惡性度顯著正相關(guān)(r=1.000，P<0.01)； LC3B陽(yáng)性表達(dá)率和mTOR 陽(yáng)性表達(dá)率顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.970，P<0.01， 圖 3)。

2.4 LC3B和mTOR在組織中的表達(dá)類型及相關(guān)性

LC3B和mTOR在組織中的表達(dá)有4 種情況,分別將其概括為如下3 種類型(表 2)： 正常表達(dá)(LC3B+mTOR-)、單異常表達(dá)(LC3B+mTOR+或LC3B-mTOR-)、雙異常表達(dá)(LC3B-mTOR+)。隨著組織惡性度的增高, LC3B和mTOR正常表達(dá)的病例比率逐漸降低(r=-1.000,P<0.01， 圖 3), 單異常表達(dá)以及雙異常表達(dá)的病例比率均逐漸增高(r=1.000,P<0.01，圖 3)。雙變量相關(guān)分析,正常表達(dá)與單異常表達(dá)、雙異常表達(dá)的病例比率均顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.975和-0.984，P<0.01， 圖 3)，單異常表達(dá)與雙異常表達(dá)病例比率顯著正相關(guān)(r=0.920，P<0.01， 圖 3)。

表 1 LC3B和mTOR在不同口腔組織中的表達(dá)強(qiáng)度

注： LC3B：正常黏膜組與OLK組，Z=-2.704，P=0.007； OLK組與OSCC組，Z=-3.791，P=0.000。 mTOR：正常黏膜組與OLK組，Z=-2.649，P=0.008； OLK組與OSCC組，Z=-3.729，P=0.000； OLK單純?cè)錾?、輕度異常增生、中度異常增生與重度異常增生組間比較， ①：P<0.05； ②：P>0.05

圖 2 mTOR在各組中的表達(dá)

注： LC3B與mTOR表達(dá)相關(guān)性， r=-0.970， P<0.01

2.5 OLK組LC3B和mTOR表達(dá)與臨床因素的相關(guān)性

表 2結(jié)果可見(jiàn)，LC3B和mTOR的表達(dá)在患者年齡、性別、病變部位及吸煙史的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在臨床類型上表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)。

2.6 OLK與臨床因素的關(guān)系

表 3顯示OLK增生程度與患者性別、病變部位、吸煙史及臨床類型的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在年齡上沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)。

3 討 論

自噬是真核細(xì)胞為維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種降解過(guò)程，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，自噬的發(fā)生受多種自噬基因調(diào)控，該調(diào)控機(jī)制失調(diào)與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展等多種病理過(guò)程密切相關(guān)[6]。LC3B為L(zhǎng)C3表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)C3A與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成的膜型，其含量與自噬發(fā)生程度正相關(guān)，被認(rèn)為是判定自噬活性的特異性靈敏標(biāo)志分子[7]。 有報(bào)道LC3B的表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，其中包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌等[8-9]。PI3K/AKT/mTOR通路是研究最多的一種癌前及致癌途徑， 該通路的過(guò)度激活與許多關(guān)鍵的癌癥行為有關(guān)[10]。其中的關(guān)鍵基因mTOR 能感受諸多信號(hào)的作用，為自噬功能的中心調(diào)控者，逆向調(diào)控自噬誘導(dǎo)及自噬體形成。目前，二者在腫瘤領(lǐng)域的研究處于不斷深入中，已有初步研究表明其與宮頸癌[11]、結(jié)腸癌[12]等惡性腫瘤中存在相關(guān)性，而在OLK惡變中的相關(guān)性尚不明確。

表 2 LC3B、 mTOR的表達(dá)與白斑臨床因素的關(guān)系

表 3 白斑與臨床因素的關(guān)系 (n=30)

Tab 3 Correlation of OLK with clinical factors

(n=30)

本研究中LC3B在口腔正常黏膜、OLK及OSCC中陽(yáng)性率逐漸降低，且在OLK由單純性增生到重度異常增生各分型中，陽(yáng)性率依次降低，差異性均顯著，表明隨組織惡性程度增加，自噬表達(dá)相對(duì)不足，推測(cè)這種不足可能與其上皮異常增生的嚴(yán)重程度有關(guān)，提示異型性明顯的細(xì)胞可能逃脫了自噬消除甚至抑制了自噬活性,而單純?cè)錾械母咚阶允蓜t起到了保護(hù)作用，從而在一定程度上緩解了黏膜的惡變傾向。LC3B陽(yáng)性率與組織惡性程度呈顯著負(fù)相關(guān)，表明其失活可以預(yù)示口腔黏膜惡變的進(jìn)程。同時(shí)，LC3B隨OLK異常增生程度增大失活增加，提示LC3B失活是存在于癌前病變中的早發(fā)事件，可以考慮作為檢測(cè)早期癌變的指標(biāo)之一。

mTOR作為自噬抑制性通路PI3K/AKT/mTOR的關(guān)鍵基因，在本研究中的陽(yáng)性率與口腔黏膜惡性程度呈顯著性正相關(guān)，提示PI3K/AKT/mTOR通路的激活[13]可能加速OLK的惡化。在白斑組織中，mTOR隨異常增生程度增大而表達(dá)增加，自噬抑制增強(qiáng)，自噬活性降低。但只在單純性增生與重度異常增生間有顯著性差異(P<0.05)，可見(jiàn)mTOR過(guò)表達(dá)在口腔黏膜惡變進(jìn)程有預(yù)測(cè)作用，而在OLK中檢測(cè)到mTOR表達(dá)量顯著增加說(shuō)明其癌變性大大增加，因此，也提示對(duì)于早期OLK癌變的檢測(cè)作用也許并不明顯。在口腔黏膜惡變進(jìn)程中，LC3B缺失率與mTOR陽(yáng)性率呈顯著性正相關(guān)，說(shuō)明二者均與口腔癌變進(jìn)程相關(guān)，這與張晶等[11]在宮頸癌的研究結(jié)果一致。再進(jìn)一步分析其相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，不論LC3B、mTOR單獨(dú)或者同時(shí)異常表達(dá)，隨組織惡性程度增加，失活表達(dá)(LC3B-、mTOR+)頻率增加。而單異常表達(dá)與雙異常表達(dá)正相關(guān)(P<0.05)，且均與正常表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明LC3B與mTOR失活在OLK發(fā)展到OSCC過(guò)程有協(xié)同作用，這一發(fā)現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外對(duì)于OLK惡變研究中未曾有報(bào)道。但單異常表達(dá)比率始終高于雙異常，因而是否存在疊加關(guān)系，并不能完全確定，還需進(jìn)一步研究。

分析LC3B和mTOR表達(dá)與OLK患者臨床因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在年齡、性別、發(fā)病部位及吸煙史方面均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在臨床類型上差異性顯著(P<0.05)，可見(jiàn)非均質(zhì)型OLK更易出現(xiàn)LC3B表達(dá)的缺失及mTOR的過(guò)表達(dá)，自噬水平降低的發(fā)生率更高，惡性程度也隨之增大，這與以往的研究報(bào)道一致。值得注意的是，表 3中將OLK按病理改變分類后，分析其與臨床因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)之前無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素，如性別、發(fā)病部位、吸煙史與OLK惡變進(jìn)程有關(guān)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析這種改變產(chǎn)生的原因，一方面，可能由于本研究樣本量相對(duì)較小，在LC3B和mTOR表達(dá)上未顯現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié)果；另一方面，考慮OLK患者中存在自噬水平的差異，而在不同的臨床因素組中，參數(shù)分布不均，差異參差不齊，很有可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于年齡因素，均未表現(xiàn)出顯著性差異。雖然50歲以上患者人數(shù)比例逐漸增多，且始終高于50 歲以下患者，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且年齡因素在以往報(bào)道中也存在分歧，考慮可能受樣本量的限制，也可能受其他不確定因素影響，如患者的文化水平、經(jīng)濟(jì)狀況、健康敏感度等不同，導(dǎo)致就診及時(shí)程度不同，因而尚不能斷定出現(xiàn)的陰性結(jié)果意味著毫無(wú)差異。由于上皮異常增生常見(jiàn)于非均質(zhì)型白斑中，兩者皆與OLK惡變有關(guān)，臨床醫(yī)生遇到此類患者應(yīng)給予高度重視，對(duì)于年齡、性別、發(fā)病部位及吸煙史，可作為輔助指標(biāo)，在臨床上也應(yīng)適當(dāng)考慮。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因LC3B 和mTOR的異常表達(dá)與口腔白斑及其惡變密切相關(guān)。隨著病變的進(jìn)展，LC3B 表達(dá)下調(diào)，mTOR表達(dá)上調(diào)，提示自噬缺陷越明顯。臨床上，應(yīng)警惕非均質(zhì)型白斑，結(jié)合臨床因素，聯(lián)合檢測(cè)LC3B與mTOR的表達(dá)有助于評(píng)估口腔白斑進(jìn)展程度。鑒于本研究尚存在局限性，期待設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)、樣本量充足的前瞻性研究，深入闡明自噬與白斑惡變間的關(guān)系，為臨床工作提供參考。