日本積水公司血漿全程C-反應(yīng)蛋白膠乳免疫比濁法最低檢測(cè)限和功能靈敏度的確認(rèn)*

謝正媛，陳涓涓，祖維磊，李奕曉，李 欣，孫 虹

(云南省人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所西部孕前優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省生育調(diào)節(jié)與少數(shù)民族優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650021)

C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是一種由肝臟合成的蛋白質(zhì)，因能與肺炎球菌細(xì)胞壁C多糖結(jié)合而得名，是目前最有價(jià)值的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，被廣泛應(yīng)用于感染性疾病[1]、各類心血管疾病的診斷及監(jiān)測(cè)[2-3]。使用檢測(cè)低限≤0.3 mg/L方法檢測(cè)到的CRP即為超敏C-反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)，其水平與動(dòng)脈粥樣硬化及急性腦梗死(ACI) 的發(fā)生、嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道我國健康人群hs-CRP的中位數(shù)為0.58～1.13 mg/L，hs-CRP濃度≥3.0 mg/L可作為心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生的潛在標(biāo)志物[5]。鑒于hs-CRP在心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的重要價(jià)值，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行hs-CRP檢測(cè)時(shí)需評(píng)估檢測(cè)低限是否滿足hs-CRP的要求，本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]對(duì)日本積水醫(yī)療株式會(huì)社全程CRP試劑最低檢測(cè)限(lowlimit of detection，LLD)和功能靈敏度(funtional sensitivity，F(xiàn)S)進(jìn)行了確認(rèn)，現(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行報(bào)道。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

1.1.1 空白樣本：根據(jù)試劑盒要求用生理鹽水為空白樣本。

1.1.2 低濃度系列檢測(cè)樣本：因試劑盒提供的最低檢測(cè)限為0.1 mg/L，以生理鹽水為稀釋液，將廠家提供的3.0 mg/L濃度標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成理論濃度為0.10，0.30，0.60，1.20，2.40和3.00 mg/L的低濃度系列樣本備用。

1.2 試劑和儀器 日本積水醫(yī)療株式會(huì)社全程CRP檢測(cè)試劑盒，CRM470校準(zhǔn)品(國際有證參考材料)，6點(diǎn)校準(zhǔn)品(3.0，6.0，30.0，180.0，300.0，420.0 mg/L)，美國雅培公司CI-16200全自動(dòng)生化分析免疫一體機(jī)。

1.3 方法 膠乳免疫比濁法。

1.3.1 取空白樣本1份批內(nèi)重復(fù)測(cè)定10次，記錄每次測(cè)定結(jié)果的吸光度A(儀器定期進(jìn)行校準(zhǔn)，檢測(cè)前做室內(nèi)質(zhì)控在控)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線：取空白樣本和6個(gè)濃度校準(zhǔn)品進(jìn)行雙份測(cè)定，記錄每次測(cè)定結(jié)果的吸光度A均值。

1.3.3 取低濃度系列樣本每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定10天，記錄每天測(cè)定結(jié)果的吸光度A。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2010統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

1.4.2 繪制低濃度系列標(biāo)準(zhǔn)曲線：將S0～S6系列樣本的吸光度A與相應(yīng)的理論濃度制成低濃度系列標(biāo)準(zhǔn)曲線備用。

1.4.3 繪制低濃度系列樣本CV%與理論濃度的曲線圖：以低濃度系列樣本的CV%為Y軸、理論濃度為X軸制圖。在圖上找到CV%最接近20%的點(diǎn)，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的分析物濃度即為CRP試劑的功能靈敏度[6-7]。

表1 空白樣本和系列低濃度樣本CRP檢測(cè)結(jié)果的吸光度A

2結(jié)果

2.1 空白樣本與6個(gè)低濃度系列樣本10次檢測(cè)結(jié)果的吸光度A見表1。由表1可見隨著樣本濃度的升高，檢測(cè)結(jié)果吸光度的CV%逐漸下降。

2.2 全程CRP試劑盒的LLD 99.7%可能性估計(jì)的LLD=A空白+3s空白=0.000 9+3×0.000 3=0.001 8A，既檢測(cè)低限的吸光度為0.001 8A，為檢測(cè)系統(tǒng)的噪聲。由表1可見0.001 8A相當(dāng)于樣本S1和S2(0.1～0.3 mg/L)之間所產(chǎn)生的吸光度，在系列低濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查閱吸光度值0.001 8A對(duì)應(yīng)的CRP理論濃度為0.21 mg/L，既全程CRP檢測(cè)方法在本實(shí)驗(yàn)室的最低檢測(cè)限為0.21 mg/L。

2.3 全程CRP試劑盒的功能靈敏度 查CRP理論濃度與吸光度CV%關(guān)系圖(圖1)可見，CV%為20%對(duì)應(yīng)的CRP理論濃度是0.27 mg/L，既全程CRP檢測(cè)方法在本實(shí)驗(yàn)室的FS為0.27 mg/L。

圖1 CRP理論濃度與吸光度CV%關(guān)系圖

3討論最低檢測(cè)限指能檢測(cè)到的樣本中分析物最小量，是基于零濃度基礎(chǔ)上檢測(cè)方法對(duì)空白樣本測(cè)定的噪音，用于區(qū)分從無到有的分析能力，臨床多用于測(cè)定人體內(nèi)不存在的分析物。功能靈敏度指在實(shí)際檢測(cè)中能夠測(cè)到的待測(cè)物最低濃度值，以天間重復(fù)CV%為20%對(duì)應(yīng)的檢測(cè)限樣本平均濃度代表某個(gè)定量檢測(cè)可報(bào)告低限。這個(gè)值一般要比最低檢測(cè)限高，用于區(qū)分從有到無的分析能力，臨床上用于測(cè)定人體內(nèi)存在的極微量分析物。hs-CRP的定量檢測(cè)限是可以為臨床提供可靠定量數(shù)據(jù)的重要限值，但本實(shí)驗(yàn)室使用的檢測(cè)方法僅提供線性范圍0.1～420 mg/L，未提供檢測(cè)低限，經(jīng)確認(rèn)最低檢測(cè)限和功能靈敏度都能滿足檢測(cè)低限≤0.3 mg/L的要求。

隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)室將會(huì)更多的采用高敏或超敏方法來檢測(cè)具有較高臨床價(jià)值的低含量物質(zhì)，除hs-CRP外目前常用的還有高敏心肌肌鈣蛋白和B型利鈉肽原等，其相關(guān)的國際或國內(nèi)指南如心力衰竭標(biāo)志物指南[8]和高敏心肌肌鈣蛋白在急性冠脈綜合征中的應(yīng)用中國專家共識(shí)[9]都對(duì)其測(cè)定方法的不精密度和檢測(cè)低限提出要求。實(shí)驗(yàn)室在使用這些方法時(shí)，應(yīng)按照行業(yè)相關(guān)要求對(duì)其檢測(cè)低限和功能靈敏度進(jìn)行確認(rèn)，以明確其性能是否滿足要求，才能讓檢驗(yàn)結(jié)果更好地服務(wù)于臨床。