三種實(shí)驗(yàn)方法檢測胸腔積液對結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值分析*

王少華，楊 翰，李愛芳，崔曉利

(西安市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710061)

在2017年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球結(jié)核病報(bào)告》中，2016年全球結(jié)核病例高達(dá)1 040萬，其中致死人數(shù)高達(dá)180萬，位居傳染病之首。為了達(dá)到“在可持續(xù)發(fā)展目標(biāo)時(shí)代終止結(jié)核病”的目標(biāo)，以及實(shí)現(xiàn)全球終止結(jié)核病[1]的愿景，結(jié)核病的預(yù)防、早期篩查診斷以及后期治療、康健等方面的工作被提升到重要戰(zhàn)略位置，其中，精準(zhǔn)診斷對結(jié)核病的病程發(fā)展具有重要影響[2]。但是至2017年，結(jié)核病診斷相關(guān)的技術(shù)手段和水平未有創(chuàng)新突破，而且世界衛(wèi)生組織也推遲了對GeneXpert Omni○R快速分子檢測平臺(tái)的評估[3]。所以，如何進(jìn)行精準(zhǔn)的診斷，需要每一位醫(yī)療工作者和科研人員的不斷探究。

結(jié)核性胸膜炎(tuberculous pleurisy，TBP)，是機(jī)體胸膜對結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生高度過敏引發(fā)的炎癥，如何高敏感度、特異地診斷出結(jié)核性胸膜炎，區(qū)分出非結(jié)核性胸膜炎，對患者的后期治療效果有著重要影響。目前臨床上大多利用超聲波、X線檢查結(jié)果進(jìn)行胸膜炎診斷，常規(guī)檢查還存在一些缺點(diǎn)，如診斷性胸腔穿刺屬于有創(chuàng)方法，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)周期長，同時(shí)不存在單一指標(biāo)進(jìn)行明確診斷的方法。筆者對193例患者標(biāo)本進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF檢測，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)[4]以及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)，分析比較三者之間敏感度、特異度、陰性預(yù)測值(negative predictive value，PV-)和陽性預(yù)測值(positive predictive value，PV+)異同以及串并聯(lián)后的結(jié)果，以探討三種方法對結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值。

1材料和方法

1.1 研究對象 選取2017年1～12月在西安市胸科醫(yī)院接受診治的的胸膜炎患者193例，其中臨床診斷為結(jié)核性胸膜炎的患者(TBP組)142例，非結(jié)核性胸膜炎患者(非TBP組)51例。TBP組中男性101例，女性41例，年齡8～88歲，平均年齡41歲；非TBP組男性40例，女性11例，年齡8～93歲，平均年齡50歲。患者的各項(xiàng)生理指標(biāo)和病理指標(biāo)均支持所做出的診斷結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn)： 臨床確診為結(jié)核性胸膜炎。其診斷標(biāo)準(zhǔn)為：排除其他病因干擾后，胸膜活檢呈現(xiàn)典型的結(jié)核病特征；胸腔積液涂片發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌[5]。

1.2 試劑和儀器 GeneXpert MTB/RIF檢測試劑盒(美國Cepheid公司)，儀器為GeneXpert擴(kuò)增檢測儀；結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)采用BACTEC MGITTM960液體培養(yǎng)管(美國BD公司)，儀器為BACTEC MGITTM960液體培養(yǎng)系統(tǒng)；結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測試劑盒(Oxford Immunotec公司)。

1.3 方法

1.3.1 GeneXpert MTB/RIF檢測：取胸腔積液30～50 ml，離心后棄掉上清，根據(jù)沉淀的性狀加入適量的處理液，室溫靜置15 min。打開反應(yīng)盒，取2 ml處理后的樣本緩慢加入反應(yīng)盒，然后上機(jī)檢測，觀察結(jié)果。

1.3.2 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)：按實(shí)際說明書進(jìn)行操作：留取患者胸腔積液30 ml以上，經(jīng)培養(yǎng)液處理后加入人淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞，再加入AIM-V培養(yǎng)液，將每個(gè)標(biāo)本的淋巴細(xì)胞數(shù)稀釋至2.5×106/ml，然后加入試劑盒附帶的包被了特異性抗原的反應(yīng)孔中，孵育16～20 min后用PBS進(jìn)行洗滌，再加入酶標(biāo)二抗和顯色劑進(jìn)行顯色，最后用顯微鏡計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果判讀：第1孔為陰性對照孔，第4孔為陽性對照孔，如陽性對照孔斑點(diǎn)數(shù)大于25個(gè)則說明實(shí)驗(yàn)成功。第2孔和3孔為測試孔，其各自與陰性對照的差值即為結(jié)果數(shù)，抗原A+抗原B>6為陽性。

1.3.3 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)：將胸腔積液靜置后取2～3 ml沉淀樣本加入1～2倍體積的4 g/dl NaOH，渦旋振蕩2～3次，室溫靜置15 min，加PBS緩沖液至40 ml，離心后棄上清加入1.5 ml PBS緩沖液，震蕩混勻放置10 min后取0.5 ml加入BACTEC MGITTM960液體培養(yǎng)管中，放入BACTEC MGITTM960液體培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。陽性結(jié)果均經(jīng)抗酸染色確認(rèn)后發(fā)出。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料比較行χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)最小理論頻數(shù)T<1或總頻數(shù)n<40，用Fisher’s Exact Test，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

相關(guān)公式：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值(PV+)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值(PV-)=真陰性例數(shù)/(假陰性例數(shù)+真陰性例數(shù))×100%；準(zhǔn)確度=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/所有患者例數(shù)×100%。串聯(lián)檢測陽性：各項(xiàng)指標(biāo)均為陽性即判斷為串聯(lián)陽性；并聯(lián)檢測陽性：各項(xiàng)指標(biāo)有一項(xiàng)陽性即判斷為并聯(lián)檢測陽性[6]。

2結(jié)果

2.1 三種檢測方法診斷效能比較 見表1。三種檢測方法敏感度比較：胸腔積液T-SPOT.TB敏感度數(shù)值為81.0%，明顯高于GeneXpert MTB/RIF檢測以及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)(表中簡稱為：結(jié)培)試驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=66.670～85.370，均P=0.000)，GeneXpert MTB/RIF檢測以及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)敏感度之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.000，P=0.045)。三種檢測方法特異度比較：T-SPOT.TB特異度為33.3%，明顯低于GeneXpert MTB/RIF檢測以及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.800～31.030，P=0.000)，GeneXpert MTB/RIF檢測以及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)特異度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.167，均P=0.041)。GeneXpert MTB/RIF檢測的PV+最高，為96.0%，T-SPOT.TB的PV-最高，為38.6%。

表1 三種診斷方法單項(xiàng)診斷能效比較

2.2 三種檢測方法的不同串聯(lián)方案的結(jié)果對比 見表2。三種方法的不同串聯(lián)方案一共有四種：分別為Xpert與T-SPOT串聯(lián)診斷、T-SPOT與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)串聯(lián)診斷、Xpert串聯(lián)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行診斷和三種不同方法共同串聯(lián)。這些方案經(jīng)實(shí)施后，所對應(yīng)四種不同的串聯(lián)方案的敏感度和特異度，經(jīng)過χ2檢驗(yàn)，將敏感度與特異度分開對比分析，其中敏感度比較結(jié)果顯示：T-SPOT串聯(lián)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方案的敏感度最大，為19.0%，與Xpert串聯(lián)T-SPOT的敏感度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.389，P=0.239)，與Xpert串聯(lián)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的敏感度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.786，P=0.016)，與三者串聯(lián)方案的敏感度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.083，P=0.001)，Xpert串聯(lián)T-SPOT方案和三者串聯(lián)方案的敏感度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.167，P=0.041)，其余方案比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；特異度比較結(jié)果顯示：四種不同串聯(lián)方案的特異度均很高，分別為98.0%，90.2%，98.0%和98.0%。

表2 三種診斷方法不同串聯(lián)方案的能效比較

2.3 三種檢測方法的不同并聯(lián)方案的結(jié)果對比 見表3。四種不同的并聯(lián)方案的敏感度和特異度對比結(jié)果，以百分比形式呈現(xiàn)。其中，Xpert與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)并聯(lián)的方案診斷的敏感度最小為29.6%，與其他三種并聯(lián)方案比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=65.636～82.000，P=0.000)，除此之外的三種并聯(lián)方案的敏感度均很高，其中Xpert/T-SPOT和三者并聯(lián)方案敏感度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.167，P=0.041)，其余方案比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。特異度結(jié)果比較可以看出，Xpert與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)并聯(lián)的方案特異度最高，為86.3%，與除其之外的三種并聯(lián)方案的特異度之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.119～25.290，P=0.000)，Xpert/T-SPOT與T-SPOT/結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)以及三種方法并聯(lián)的方案之間的特異度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Xpert與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)并聯(lián)的PV+最高，為85.7%，T-SPOT與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)并聯(lián)的PV-最高，為44.1%。

3討論一直以來，結(jié)核病在全球性傳染病排行榜中占據(jù)重要一席[7]，傳染性和致死率居高不下，致使諸多發(fā)展中國家成為疫情重災(zāi)區(qū)，其也成為困擾我國居民健康生活的一大難題。結(jié)核病有不同的類型，每種類型的病程特點(diǎn)以及耐藥性質(zhì)等都存在不同。其中，第五類型的結(jié)核病，即結(jié)核性胸膜炎[8]，在臨床上較為常見。其與非結(jié)核性胸膜炎的區(qū)分診斷，以及對一線抗結(jié)核藥物的耐藥程度的判斷[9]，成為困擾諸多醫(yī)療工作者和科研人員的一大難題。目前臨床上診斷結(jié)核性胸膜炎的“金指標(biāo)”一般是通過檢測患者的痰樣本、胸腔積液樣本或胸膜活檢組織樣本，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)其中存在的抗酸桿菌或培養(yǎng)得到結(jié)核分枝桿菌；還有在排除其他引起肉芽腫的疾病情況下，能夠在胸膜組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)肉芽腫組織存在干酪性壞死現(xiàn)象。但是這些金指標(biāo)存在諸如培養(yǎng)時(shí)間長、有創(chuàng)、有感染風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)，會(huì)造成患者確診時(shí)間以及治療時(shí)間的延后，對患者產(chǎn)生巨大影響。

GeneXpert MTB/RIF檢測技術(shù)是一種新型的分子生物學(xué)快速診斷技術(shù)，其檢測診斷系統(tǒng)運(yùn)用半巢式RT-PCR及熒光探針技術(shù)，特異性擴(kuò)增并檢測結(jié)核分枝桿菌特有的并與利福平耐藥密切相關(guān)的rpoB基因片段，以PCR循環(huán)閾值反映標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌量，進(jìn)行半定量分析，具有快速、敏感、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以在2 h內(nèi)報(bào)告結(jié)果，操作簡便。T-SPOT.TB的檢測原理是外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(CFP-10，ESAT-6)的刺激后，分泌γ干擾素(INF-γ)，通過對INF-γ的分泌情況進(jìn)行檢測來判斷結(jié)核分枝桿菌的感染情況。有研究顯示，經(jīng)過CFP-10，ESAT-6刺激后，胸腔積液中的效應(yīng)T細(xì)胞釋放斑點(diǎn)數(shù)明顯高于外周血效應(yīng)T細(xì)胞釋放的斑點(diǎn)數(shù)，胸腔積液的T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)對于結(jié)核的診斷效果明顯高于外周血[10]。這些技術(shù)如今已發(fā)展穩(wěn)定，聯(lián)合診斷方案是否具備更好的敏感度和較高的特異度已經(jīng)成為一項(xiàng)重要的議題。有研究表明，單項(xiàng)檢測時(shí)T-SPOT.TB具有優(yōu)于其他方法的敏感度[11-12]，聯(lián)合GeneXpertt MTB/RIF的特異度可以對結(jié)核性胸膜炎實(shí)現(xiàn)快速而精確的診斷和假陽性排除，與此同時(shí)GeneXpertt MTB/RIF能夠判斷是否為利福平耐藥，進(jìn)而便于對癥下藥[13]。除此之外的結(jié)核培養(yǎng)試驗(yàn)也較為常見[14]，但由于其培養(yǎng)時(shí)間長，常常會(huì)延長診療時(shí)間。因此，選擇快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法或是與其他方法儀器進(jìn)行聯(lián)合診斷對結(jié)核性胸膜炎患者的早期診斷、早期指導(dǎo)具有重要意義。

本研究選取了上述較常使用的結(jié)核性胸膜炎診斷方法，對胸腔積液標(biāo)本進(jìn)行檢測，進(jìn)而分析三種方法的不同串聯(lián)方案以及并聯(lián)方案是否對診斷效果有重大影響。需要注意的是：在非TBP組中有7例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)為陽性，經(jīng)培養(yǎng)菌液涂片行抗酸染色后見散在抗酸桿菌生長，無索狀生長形態(tài)，后對菌液進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定(北京博奧)為非結(jié)核分枝桿菌感染；在非TBP組中有一例GeneXpertt MTB/RIF檢測為陽性，后經(jīng)過對標(biāo)本的追蹤調(diào)查及復(fù)查，以及對病例的分析判定為標(biāo)本污染；本研究中結(jié)核性胸膜炎組中仍有少數(shù)患者T-SPOT.TB為陰性，可能有以下幾種情況：①免疫系統(tǒng)功能不全的疾病如HIV患者，免疫抑制劑使用患者等；②標(biāo)本獲取時(shí)間在細(xì)胞免疫發(fā)生前；③前期進(jìn)行抗結(jié)核治療可使效應(yīng)細(xì)胞消失；④實(shí)驗(yàn)非正常操作引起[15]。

本研究結(jié)果顯示：三種方法獨(dú)立性差異比較，T-SPOT.TB的敏感度為81.0%，顯著高于其他兩種方法，表明作為獨(dú)立指標(biāo)進(jìn)行診斷時(shí)具有較大參考意義，這也與其他學(xué)者研究結(jié)果相符[16]，但由于T-SPOT.TB檢測屬于免疫學(xué)檢測，缺乏病原學(xué)指標(biāo)，并不能作為確診依據(jù)；四種串聯(lián)方案之間的敏感度均較低(19%以下)，但串聯(lián)方案的特異度均很高(90%以上)，表明三種方案之間可以串聯(lián)排除結(jié)核分枝桿菌感染情況。三種實(shí)驗(yàn)并聯(lián)具有最高的敏感度(87.3%)，說明三者并聯(lián)能夠診斷大多數(shù)的結(jié)核性胸膜炎，對結(jié)核性胸膜炎的篩檢較為實(shí)用；Xpert與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)并聯(lián)具有最高的特異度(86.3%)，表明可以該兩種方案綜合評價(jià)診斷進(jìn)而排除假陽性和假陰性的干擾；與此同時(shí)，三者并聯(lián)之間的敏感度和特異度與除Xpert與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)并聯(lián)判斷之外的方案相比，沒有明顯的差別，所以可以選擇三種方案中的一種進(jìn)行診斷。

綜上所述，單項(xiàng)檢驗(yàn)時(shí)T-SPOT.TB方法較為靈敏。臨床應(yīng)用中可以采用除Xpert與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試驗(yàn)并聯(lián)之外的三種不同方法并聯(lián)的診斷方案進(jìn)行綜合判斷，進(jìn)而能夠高度靈敏地篩查出結(jié)核性胸膜炎。四種串聯(lián)方案具有較高的特異度，對結(jié)核性胸膜炎的確診提供有力證據(jù)。