甘肅省天水地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌致尿路感染的基因分型及耐藥性分析*

楊宏斌，張 妍

(天水市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，甘肅天水 741000)

尿路感染又稱泌尿系統(tǒng)感染，是由各種病原體入侵泌尿系統(tǒng)引起的疾病，根據(jù)有無梗阻、結(jié)石、畸形、膀胱輸尿管反流等尿路異常情況分為復(fù)雜性和非復(fù)雜性尿路感染[1]。大腸埃希菌是引起尿路感染的最常見病原菌，國內(nèi)復(fù)雜性尿路感染細(xì)菌譜的特點(diǎn)是大腸埃希菌感染比例降低，而產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrump-beta-lactamases，ESBLs)大腸埃希菌菌株比例升高，且各地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌基因型分布有一定差異[2]。本研究收集2017年1月～2018年10月住院患者尿培養(yǎng)分離的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌1 003株，通過檢測ESBLs基因型和藥物敏感性試驗分析，了解本地區(qū)尿路感染產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥基因型流行性及耐藥現(xiàn)狀，從而為指導(dǎo)臨床用藥和院內(nèi)感染的防控提供參考。

1材料與方法

1.1 研究對象 收集我院2017年1月～2018年10月尿路感染患者非重復(fù)分離的尿培養(yǎng)大腸埃希菌2 126株，其中產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌菌株1 003株。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)格按《尿路感染臨床微生物實驗室診斷》2016標(biāo)準(zhǔn)要求，選取尿路感染患者中段尿進(jìn)行培養(yǎng)，菌落計數(shù)(CFU)≥105cfu/ml判斷為尿路感染病例。

1.2 儀器與試劑 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(德國布魯克公司提供)；ABI7500實時熒光PCR儀(美國ABI公司)；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；Taqdna聚合酶(大連寶生物工程有限公司)；bio-rad電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(美國bio-rad公司)。K-B法藥敏紙片購自溫州康泰生物公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及藥物敏感性試驗：嚴(yán)格按《尿路感染臨床微生物實驗室診斷》2016標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和分純，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF)進(jìn)行鑒定，藥物敏感性試驗采用K-B法測定各種抗生素的抑菌圈直徑。結(jié)果根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI 2017)標(biāo)準(zhǔn)判讀[3]。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。使用WHONET5.6對目的菌株進(jìn)行藥物敏感性分析。

1.3.2 ESBLs表型檢測：按照CLSI2017推薦的雙紙片協(xié)同法進(jìn)行表型確證試驗，即采用頭孢噻肟及頭孢噻肟/克拉維酸，頭孢他啶及頭孢他啶/克拉維酸兩組紙片進(jìn)行試驗，加克拉維酸比不加克拉維酸抑菌環(huán)直徑≥5 mm時，判定為產(chǎn)ESBLs菌株。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC70063分別作為ESBLs確證試驗的陰性和陽性質(zhì)控菌株。

1.3.3 ESBLs基因型檢測：采用改良堿裂解法[4]提取細(xì)菌質(zhì)粒總DNA，取2 μl提取物作為模板，多重PCR檢測blaTEM，blaCTX-M，blaSHV，blaOXA，blaCTX-M-14，bla CTX-M-15和blaCTX-M-3基因型，使用引物序列見表1。反應(yīng)體系25 μl，ESBLs基因擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，變性95℃30 s，退火56℃30 s，延伸70℃40 s，32個循環(huán)，最后72℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物1 g/dl的瓊脂糖凝膠電泳后，溴乙啶染色，在紫外線下觀察產(chǎn)物片段。

表1 耐藥基因引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用χ2檢驗和Fisher確切概率法；藥敏試驗數(shù)據(jù)運(yùn)用WHONET5.6進(jìn)行處理分析。

2結(jié)果

2.1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的分布情況 本研究收集尿路感染患者尿培養(yǎng)大腸埃希菌2 126株，經(jīng)確證試驗證實產(chǎn)ESBLs 菌株1 003株，產(chǎn)酶率47.2%?？剖曳植继攸c(diǎn)：泌尿外科檢出475株，占47.4%，內(nèi)分泌科(糖尿病患者為主)檢出216株，占21.5%，神經(jīng)外科檢出105株，占10.5%，腫瘤科檢出81株，占8.1%，婦產(chǎn)科檢出69株，占6.9%，急診科檢出55株，占5.5%，其他科室檢出2株占0.2%。

2.2 細(xì)菌敏感性分析 與非產(chǎn)酶株比較，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對于青霉素類、1～3代頭孢菌素、單環(huán)類、氟喹諾酮類、磺胺類的耐藥率均超過80%，僅對亞胺培南、美羅培南、磷霉素和呋喃妥因的耐藥率小于5%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；具體藥物敏感性分析結(jié)果見表2。

表2 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥率分析[n(%)]

注：*示Fisher’s精確概率。

2.3 基因型分布特點(diǎn) 對1 003株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌菌株的耐藥基因型檢測，結(jié)果blaCTX-M基因624株、bla-TEM型287株、bla-SHV型51株、bla-OXA型30株，7株同時攜帶2種不同耐藥基因。部分基因型PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見表3、圖1。

2.4 攜帶不同耐藥基因模式與細(xì)菌耐藥性的分析 1 003株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌攜帶1種基因型的單一模式624株，同時攜帶2種不同基因型的復(fù)合模式7株。分析復(fù)合模式blaCTX-M-14+ bla-TEM型、blaCTX-M-15+ bla-TEM型和blaCTX-M-3+ bla-TEM型對頭孢他啶耐藥率分別為57.1%(4/7)，28.5%(2/7)和14.2%(1/7)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.73，P<0.01)。

表3 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥基因型分布情況

M：Marker；1～2：CTX型；3～4：TEM型；5：SHV型；6：OXA型。

3討論大腸埃希菌是引起臨床各種感染性疾病的重要病原菌，以泌尿系統(tǒng)感染為主，由其入侵尿道導(dǎo)致的尿路感染影響了全球超過1.5億人口，其高復(fù)發(fā)率和日趨嚴(yán)重的抗生素抵抗正成為社會公共衛(wèi)生的重大負(fù)擔(dān)[5]。2017年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CARSS)結(jié)果調(diào)查表明，大腸埃希菌ESBLs產(chǎn)酶率為52.2%，本研究顯示，天水地區(qū)近2年產(chǎn)酶率為47.2%，略低于全國平均水平[6]，這與國家對抗生素管理的不斷加強(qiáng)及臨床對細(xì)菌耐藥性的認(rèn)識水平提高有關(guān)。

尿路感染以其嚴(yán)重的后遺癥(包括腎盂腎炎膿毒癥、嬰幼兒腎損害和早產(chǎn)等)成為威脅新生兒、老年人和婦女等人群健康的主要疾病之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌致尿路感染首位發(fā)生于泌尿外科，其次為內(nèi)分泌科和神經(jīng)外科。分析可能原因，大部分病例有長期留置導(dǎo)尿管、中心靜脈置管、體外碎石術(shù)、腎移植術(shù)、腦室-腹腔分流術(shù)等有創(chuàng)操作，部分病例存在糖尿病、自身免疫病、高齡患者等的基礎(chǔ)疾病，其機(jī)制為臨床侵入性操作損傷了機(jī)體的黏膜屏障作用，使腸道菌群發(fā)生了明顯異位，伴隨患者組織修復(fù)能力減弱及代謝改變，造成機(jī)體對病原菌的感染防御功能減低，促使多重耐藥菌的感染與傳播，這與嚴(yán)海忠等[7]人報道一致。

本研究對天水地區(qū)大腸埃希菌尿路感染的耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對19種臨床抗生素的耐藥率都高于非產(chǎn)酶組，對亞胺培南、美羅培南、磷霉素和呋喃妥因耐藥率分別為1.1%，0.9%，4.4%和2.6%，2018年CNINET上半年數(shù)據(jù)顯示，大腸埃希菌對碳青霉烯類的耐藥率為1.5%，對磷霉素和呋喃妥因的耐藥率分別為5.2%和3.6%，與本研究結(jié)果相符。這提示臨床，對于急性單純性下尿路感染的輕癥患者，建議應(yīng)用口服磷霉素氨丁三醇或呋喃妥因治療，并適用于尿路感染的維持治療或降階序貫治療[8]。但對于有急危重癥及放化療尿路感染患者，建議首選碳青霉烯類治療[9]。因此，對于產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌引起的尿路感染患者的管理，除根據(jù)藥物敏感試驗結(jié)果選擇有效抗生素種類外，還需加強(qiáng)床旁的隔離防護(hù)措施，避免耐藥菌的水平傳播。

由質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs酶是大腸埃希菌重要耐藥機(jī)制，目前全世界共發(fā)現(xiàn)了200多種ESBLs，根據(jù)編碼基因的同源性分為blaCTX-M，blaTEM，blaSHV，blaOXA和其他共5大類型[10]。近年來，大腸埃希菌致尿路感染臨床治療現(xiàn)狀為，對復(fù)雜性尿路感染患者在獲得藥敏試驗結(jié)果之前經(jīng)常采用經(jīng)驗性治療或不規(guī)范的抗生素治療，導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)。CHINET耐藥監(jiān)測網(wǎng)和全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CRASS)的數(shù)據(jù)顯示，近8年來我國大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs發(fā)生率在50%～60%，基因型90% 以上為CTX-M型，由于我國人群地域分布特點(diǎn)不同及抗生素的個體化差異，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌菌株的耐藥基因表型流行特征也不盡相同[2]。本研究顯示，天水地區(qū)產(chǎn)ESBLS大腸埃希菌耐藥基因型以 blaCTX-M-14表型為主，其次為blaTEM表型，blaSHV和blaOXA表型小于10%，這與徐學(xué)靜等[11]報道一致，而與周杰等[12-13]報道的blaCTX-M亞型有差別，可能與地域差異及臨床用藥習(xí)慣有關(guān)[14]。本研究首次分析了產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌不同攜帶模式菌株對頭孢他啶的耐藥率，結(jié)果顯示，攜帶blaCTX-M-14型及blaCTX-M-14+ bla-TEM型對頭孢他啶具有更高的耐藥率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，天水地區(qū)尿路感染患者產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌以bla-CTX-M-14和bla-TEM基因型占絕對優(yōu)勢，攜帶模式以單一模式為主，復(fù)合模式較少見，未見其它模式；產(chǎn)ESBLs菌株呈現(xiàn)多重耐性，但對碳青霉烯類、磷霉素和呋喃妥因呈現(xiàn)較低的耐藥率，可指導(dǎo)本地區(qū)臨床合理使用抗生素和防控該菌耐藥基因的水平傳播提供參考依據(jù)。