宮頸組織HPV DNA與血清Chemerin，Leptin水平聯(lián)合檢測對宮頸癌早期診斷的價(jià)值分析*

陳 慎，杜明君，宋雅琴

(珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科 珠海市第二人民醫(yī)院，廣東珠海 519000)

宮頸癌是臨床婦產(chǎn)科常見的惡性腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)，每年約有新增病例53萬，約有25萬女性因該病死亡。在該病的發(fā)生發(fā)展過程中，歷經(jīng)癌前病變、早期浸潤、浸潤癌三個(gè)階段。在早期階段，臨床表現(xiàn)不明顯，不易引起患者注意，但早期診斷有利于及早采取有效治療措施，控制病情發(fā)展，甚至可恢復(fù)患者健康[1-3]。目前臨床診斷宮頸癌的方式主要為陰道鏡、宮頸刮片等傳統(tǒng)方式，具有漏診的可能，分子水平檢測可避免由于取樣位置偏差而導(dǎo)致的漏診[4]。提高宮頸癌分子診斷的靈敏度與特異度，對于早期發(fā)現(xiàn)癌變具有十分重要的意義。大量研究表明[5-6]，宮頸癌組織中的高危型HPV檢出率可達(dá)99%，高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生和宮頸上皮瘤變(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)的重要因素。趨化素(Chemerin)是脂肪因子家族成員，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖的作用，在宮頸癌患者體內(nèi)水平升高[7]。瘦素(Leptin)具有調(diào)節(jié)能量代謝的作用，促進(jìn)新生血管生成，參與腫瘤組織新生血管的形成過程[8]。Chemerin和Leptin均與FIGO分期、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究探討HPV DNA，Chemerin和Leptin聯(lián)合檢測對宮頸癌的診斷意義。

1材料與方法

1.1 研究對象 以2015年3月～2018年3月期間我院收治的82例宮頸癌患者為宮頸癌組，選取同期在我院門診或體檢診斷為宮頸上皮瘤變(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)的78例患者為CIN組，另選同期于我院體檢正常者76例為對照組。其中宮頸癌組患者根據(jù)2000年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(federation international of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO)分期[10]ⅠA，ⅠB，ⅡA，ⅡB和Ⅲ期分別有19例、18例、22例、9例和14例。三組研究對象的年齡、BMI等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)，見表1。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象已簽署知情同意書。

表1 三組研究對象一般資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸癌組患者均經(jīng)過病理診斷符合宮頸癌及癌前病變規(guī)范化診療指南(試行)[9]中關(guān)于宮頸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②宮頸癌組患者均為首次確診為宮頸癌；③對照組的血細(xì)胞計(jì)數(shù)、肝腎功能、血脂等均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)妊娠者；②入院前3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過免疫抑制相關(guān)治療者；③并發(fā)其它部位惡性腫瘤或代謝性疾病(如糖尿病等)；入院前進(jìn)行過放療或化療者等。

1.2 方法

1.2.1 儀器、試劑和檢測方法

1.2.1.1 HPV DNA檢測：應(yīng)用宮頸采樣器于研究對象宮頸口順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5圈后，立即置入含有保護(hù)劑的試管，操作中避免血液及其他宮頸分泌物污染，4℃下保存，14天內(nèi)進(jìn)行檢測。采用第二代雜交捕獲技術(shù)(HC2)檢測研究對象的高危型HPV DNA的陽性率。

1.2.1.2 Chemerin檢測：于清晨空腹時(shí)采用肝素抗凝真空采血管采集研究對象的肘靜脈血4 ml，4℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液，-80℃下保存待測。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清Chemerin水平，檢測試劑盒購自Peprotech公司，操作均嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明進(jìn)行，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Chemerin，全部樣品均設(shè)立復(fù)孔檢測。

1.2.1.3 Leptin檢測：于清晨空腹時(shí)采集研究對象的肘靜脈血5 ml置于不抗凝管中，4℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液，-80℃保存待測。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清Leptin水平，檢測試劑盒購自Peprotech公司，操作均嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明進(jìn)行，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Leptin全部樣品均設(shè)立復(fù)孔檢測。

1.2.2 研究方案

1.2.2.1 比較宮頸癌組、CIN組和對照組三組的HPV DNA，Chemerin和Leptin的水平情況。

1.2.2.2 宮頸癌組中HPV DNA分別聯(lián)合Chemerin和Leptin的靈敏度和特異度的比較。

1.2.2.3 三者聯(lián)合診斷宮頸癌的靈敏度和特異度，并繪制ROC曲線進(jìn)行分析比較。

1. 3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) HPV DNA：14種HPV高危型(16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)檢出任一種即判定為陽性；Chemerin>1 865.42 ng/ml判定為陽性；Leptin>9.54 ng/ml判定為陽性；平行聯(lián)合檢測判定：檢測方法中任一指標(biāo)呈陽性即判定為陽性；系列聯(lián)合檢測判定：檢測方法中全部指標(biāo)檢測為陽性則判定為陽性。

2結(jié)果

2.1 HPV DNA，Chemerin，Leptin水平比較

2.1.1 HPV DNA和Chemerin組間比較：見表2。三組的Chemerin水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且宮頸癌組高于CIN組和對照組，CIN組高于對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，三組HPV DNA的陽性率不同(P<0.05)，且兩兩比較，宮頸癌組高于CIN組和對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<α’)，CIN組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>α’)。

表2 三組研究對象的HPV DNA，Chemerin情況比較

注：Chemerin水平，與CIN組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05。HPV DNA陽性，與CIN組比較，cP<α’；與對照組比較，dP<α’。

2.1.2 Leptin濃度組間比較：見表3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，宮頸癌組的中位Leptin濃度高于CIN組和對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CIN組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 HPV DNA，Chemerin和Leptin分別單獨(dú)檢測的診斷效能 見表4。以病理檢查結(jié)果作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，Leptin單獨(dú)檢測的靈敏度最高；HPV DNA單獨(dú)檢測的特異度最高；Leptin單獨(dú)檢測的準(zhǔn)確度最高。

表3 三組研究對象的血清Leptin情況比較(ng/ml)

表4 HPV DNA，Chemerin，Leptin分別單獨(dú)檢測的診斷效能[%(n)]

2.3 血清HPV DNA，Chemerin和Leptin聯(lián)合診斷效能 以病理檢查結(jié)果作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，分析HPV DNA+Chemerin，Chemerin+Leptin，HPV DNA+Leptin，HPV DNA+Chemerin+Leptin平行聯(lián)合檢測和系列聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度，見表5，表6。HPV DNA+Chemerin+Leptin平行聯(lián)合檢測的特異度較高，但敏感度較低，HPV DNA+Chemerin+Leptin系列聯(lián)合檢測的敏感度和特異度均較高。

表5 HPV DNA，Chemerin，Leptin平行聯(lián)合檢測的診斷效能[%(n)]

表6 HPV DNA，Chemerin，Leptin系列聯(lián)合檢測的診斷效能[%(n)]

2.4 HPV DNA，Chemerin和Leptin聯(lián)合檢測診斷宮頸癌的ROC曲線分析 HPV DNA+ Chemerin，Chemerin+Leptin，HPV DNA+Leptin，HPV DNA + Chemerin+Leptin平行聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積依次為0.735，0.717，0.654和0.818，三者平行聯(lián)合檢測的曲線下面積高于任意兩者平行聯(lián)合檢測(P<0.05)，見圖1。系列聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積依次為0.709，0.697，0.650和0.860，三者系列聯(lián)合檢測的曲線下面積高于任意兩者系列聯(lián)合檢測(P<0.05)，見圖2。

圖1平行聯(lián)合檢測ROC曲線圖 圖2系列聯(lián)合檢測ROC曲線圖

3討論宮頸癌是臨床婦科的一種常見腫瘤，發(fā)生于女性生殖系統(tǒng)，其發(fā)病率與病死率均較高。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)[11-12]，在發(fā)展中國家宮頸癌在女性惡性腫瘤中的發(fā)病率僅次于乳腺癌，死亡率僅次于乳腺癌與肺癌，我國每年新發(fā)病例約有10萬，占世界新發(fā)病例的1/5。宮頸癌早期篩查可早期發(fā)現(xiàn)病例，積極治療，對于提高宮頸癌患者的生活質(zhì)量及生存時(shí)間均具有重要意義。目前，臨床主要的診斷方法有陰道鏡、宮頸刮片等，但分子生物學(xué)檢測，能夠從血清水平對指標(biāo)進(jìn)行檢測，從而避免由于視野局限或取樣位置不準(zhǔn)確等所造成的漏診。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組的HPV DNA陽性率高于CIN組和對照組(P<0.05)，反映出其與宮頸癌可能具有一定相關(guān)性。研究認(rèn)為[13]，HPV感染是誘發(fā)宮頸癌的重要啟動因素，其持續(xù)感染導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低，宮頸局部微環(huán)境發(fā)生變化，HPV DNA整合在宿主染色體脆位區(qū)，引起患者癌基因E6，E7過度表達(dá)，并在其他致癌因素輔助下抑制抑癌基因p53，Rb等表達(dá)，激活端粒酶活性，通過抑制細(xì)胞凋亡、逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視等導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常演化為癌細(xì)胞。韓欽[14]的研究也顯示，HPV檢測對宮頸癌具有診斷意義，可用于宮頸癌的早期篩查。

Chemerin是脂肪因子家族的一員，具有趨化白細(xì)胞的功能，因此也被命名為趨化素，參與代謝綜合征以及相關(guān)疾病的病理生理過程，亦可通過活化G蛋白偶聯(lián)受體ChemR23，趨化不成熟的樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位，參與腫瘤細(xì)胞的免疫過程；與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的CMKLR1受體集合，起到誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和促進(jìn)新生血管叢形成的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖生長[7，15]。本研究中，研究對象的血清Chemerin水平，宮頸癌組高于CIN組和對照組(P<0.05)，CIN組高于對照組(P<0.05)，表明隨著疾病的發(fā)生發(fā)展，患者的血清Chemerin水平升高，對于宮頸癌的預(yù)測有一定意義。劉雪峰等[15]的研究也顯示，宮頸癌患者的血清Chemerin水平明顯升高，且與FIGO分期關(guān)系密切，對宮頸癌的進(jìn)展具有指導(dǎo)作用。

Leptin是一種非特異性促腫瘤細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)血管生成、增加細(xì)胞的侵襲性、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖分化等作用，且還通過JAK/STAT，HIF，TGF-β等通路參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等[16]。本研究結(jié)果表明Leptin在三組中的水平有所不同(P<0.05)，表明其可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。張婧等[16]學(xué)者通過對宮頸癌患者血清和腫瘤組織中Leptin的表達(dá)水平研究也發(fā)現(xiàn)，比正常人升高，與本研究結(jié)果類似。

本研究以病理診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，對HPV DNA，Chemerin和Leptin檢測用于宮頸癌診斷進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，三者的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度均不高，尚不足以作為單獨(dú)檢測診斷宮頸癌的依據(jù)。通過分析聯(lián)合檢測的診斷效能發(fā)現(xiàn)，三者系列聯(lián)合檢測的敏感度(74.39%)、特異度(74.36%)和準(zhǔn)確度(74.38%)高于任意兩者系列聯(lián)合檢測，且敏感度與準(zhǔn)確度均高于三者平行聯(lián)合檢測，特異度則相差無幾，同時(shí)系列聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積(0.860)高于平行聯(lián)合檢測(0.818)，因此三者系列聯(lián)合檢測診斷效能較高，具有較高的診斷價(jià)值，三者系列聯(lián)合檢測更加適用于宮頸癌的早期診斷。

綜上所述，HPV DNA，Chemerin，Leptin與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，三者系列聯(lián)合檢測均可提高診斷效能，對于宮頸癌的早期診斷、及早干預(yù)具有積極意義。