溴甲酚綠法檢測低濃度血清清蛋白的偏差分析和臨床診斷應(yīng)用的局限性*

劉 非，邱先桃，楊麗媛，陳小娟，趙學(xué)芹，丘媛媛，張素娟，楊紅玲

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗部，廣州 510623)

清蛋白是人體血漿中最豐富的蛋白，約占血漿總蛋白量的50%～60%。血清清蛋白也是最常用的實驗室檢測指標(biāo)之一。清蛋白構(gòu)成了血液大約70%～80%的膠體滲透壓[1]，清蛋白主要有兩方面生理功能：①維持血漿膠體滲透壓。②與各種配體結(jié)合，起運輸功能，并參與機(jī)體代謝、抗氧化、抗凝等[2-4]。

高清蛋白血癥主要是由脫水引起[5]，而低蛋白血癥可由多種疾病引起。除了為蛋白質(zhì)狀態(tài)和蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良的標(biāo)志外[6-7]，更為重要的是可作為肝腎等重要器官病變及疾病嚴(yán)重程度的預(yù)后標(biāo)志物[8]，也是終末期腎病、老年患者和髖關(guān)節(jié)骨折等患者的預(yù)后指標(biāo)[9-10]。

血清清蛋白目前的檢測方法包括溴甲酚綠法(bromocresol green，BCG)、溴甲酚紫法(bromocresol purple，BCP)和免疫比濁法。據(jù)報道，BCG法因非特異地與α1-和α2-球蛋白，及轉(zhuǎn)鐵蛋白、C-反應(yīng)蛋白(CRP)等急性時相蛋白反應(yīng)，高估清蛋白水平[11-12]，造成低清蛋白血癥的漏診或誤診。我科引入了免疫比濁法檢測血清清蛋白，該方法是檢驗醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會(the joint committee for traceability in laboratory medicine，JCTLM)指定的人血清清蛋白檢測的參考方法，可溯源到國際參考物質(zhì)ERM-DA470k/IFCC[13-14]。為向臨床正確推薦選擇合適的檢測方法，評估現(xiàn)用的BCG法與參考方法在我院常見患者中血清清蛋白檢測結(jié)果的差異。

1材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年6～10月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心進(jìn)行靜脈采血檢測的患者全血樣本2 ml，收集于分離膠采血管，1 800 r/min離心8 min，分離血清，采用BCG法和免疫比濁法同時檢測血清清蛋白。

1.2 儀器與試劑 全自動生化分析儀(HITACHI 7600-020)，BCG法清蛋白檢測試劑盒(邁克生物，批號：0318071)，BCG法清蛋白檢測校準(zhǔn)品(邁克生物，批號：0718071)，BCG法清蛋白檢測質(zhì)控品(RANDOX，批號：1226UN，913UE)。免疫比濁法清蛋白檢測試劑盒(Orion，批號：1822780)，免疫比濁法清蛋白檢測校準(zhǔn)品(Orion，批號：1805558)，免疫比濁法清蛋白檢測質(zhì)控品(批號：1502119P，1502118L)。兩種方法均經(jīng)過性能驗證，精密度、準(zhǔn)確度滿足《WS/T 403-2012臨床生物化學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量指標(biāo)》的要求，分析測量范圍符合試劑盒聲明的范圍，參考區(qū)間滿足《WS/T 404.2-2012臨床常用生化檢驗項目參考區(qū)間第2部分：血清總蛋白、清蛋白》的區(qū)間。

1.3 方法

1.3.1 在臨床決定水平濃度區(qū)間內(nèi)比較BCG法與免疫比濁血清清蛋白檢測結(jié)果：選擇臨床樣本BCG法血清清蛋白檢測結(jié)果在8.0～60.0 g/L內(nèi)的樣本40例。BCG法和免疫比濁法分別檢測樣本兩次，取平均值。以BCG法結(jié)果為橫坐標(biāo)，免疫比濁法結(jié)果為縱坐標(biāo)，觀察數(shù)據(jù)的分布，并計算線性擬合方程。以免疫比濁法結(jié)果為橫坐標(biāo)，BCG法與免疫比濁法結(jié)果的絕對差值為縱坐標(biāo)，觀察數(shù)據(jù)的分布情況。評價偏差大小時，因關(guān)注偏差最顯著的低值清蛋白檢測結(jié)果，未使用6%的總允許誤差來評估，而采用了±2 g/L的絕對偏差作為界限。

1.3.2 BCG法與免疫比濁法血清清蛋白檢測結(jié)果在腎相關(guān)疾病患者中的比較：選擇腎內(nèi)科患者樣本30例，BCG法和免疫比濁法分別檢測樣本兩次，取平均值。以免疫比濁法結(jié)果為橫坐標(biāo)，BCG法與免疫比濁法結(jié)果的絕對差值為縱坐標(biāo)，觀察數(shù)據(jù)的分布情況。

1.3.3 BCG法與免疫比濁法血清清蛋白檢測結(jié)果在孕產(chǎn)婦中的比較：選擇妊娠中期和妊娠晚期孕婦樣本共36例，BCG法和免疫比濁法分別檢測樣本兩次，取平均值。以免疫比濁法結(jié)果為橫坐標(biāo)，BCG法與免疫比濁法結(jié)果的絕對差值為縱坐標(biāo)，觀察數(shù)據(jù)的分布情況。

1.3.4 BCG法與免疫比濁法血清清蛋白檢測結(jié)果在新生兒中的比較：選擇新生兒樣本共34例，BCG法和免疫比濁法分別檢測樣本兩次，取平均值。以免疫比濁法結(jié)果為橫坐標(biāo)，BCG法與免疫比濁法結(jié)果的絕對差值為縱坐標(biāo)，觀察數(shù)據(jù)的分布情況。

1.3.5 BCG法與免疫比濁法血清清蛋白檢測結(jié)果在血液病患者中的比較：選擇血液病患者樣本共31例，BCG法和免疫比濁法分別檢測樣本兩次，取平均值。以免疫比濁法結(jié)果為橫坐標(biāo)，BCG法與免疫比濁法結(jié)果的絕對差值為縱坐標(biāo)，觀察數(shù)據(jù)的分布情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用IBM SPSS statistics 20軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，相關(guān)性檢驗采用Pearson法，以P<0 .05為存在相關(guān)性，以相關(guān)系數(shù)絕對值>0.8為有高度相關(guān)關(guān)系。作圖采用Excel 2007。

2結(jié)果

2.1 BCG法與免疫比濁法血清清蛋白檢測結(jié)果比較 在8.0～60.0 g/L臨床常見清蛋白濃度區(qū)間內(nèi)比較兩種方法檢測結(jié)果，兩種檢測方法經(jīng)線性擬合后，回歸方程為Y=1.2X～7.845 6，r2= 0.982 1，見圖1。結(jié)果差值與清蛋白濃度的關(guān)系見圖2，經(jīng)Pearson相關(guān)性檢驗，P<0.01，相關(guān)系數(shù)為-0.854，高度負(fù)相關(guān)。清蛋白濃度越低，兩者差值越大。針對患者臨床資料具體分析，圖2顯示：框1中為4例清蛋白濃度小于20 g/L的樣本均為腎病綜合征患者，BCG法高估清蛋白5～7 g/L；框2中5例清蛋白濃度介于20～30 g/L的樣本，3例為妊娠，1例新生兒壞死性小腸炎，1例肝功能不全幼兒，BCG法高估清蛋白2～4 g/L；框3中6例清蛋白濃度介于30～40 g/L的樣本，全部為妊娠；框4中4例清蛋白濃度介于20～30 g/L的患者，兩種方法清蛋白檢測差值小于±2 g/L；框5中5例清蛋白濃度高于50g/L的患者，BCG法低估清蛋白2～4 g/L。

圖1 BCG法與免疫比濁法清蛋白檢測結(jié)果比較 圖2 BCG法與免疫比濁法清蛋白檢測結(jié)果的偏差與清蛋白濃度的關(guān)系

2.2 腎內(nèi)科患者BCG法與免疫比濁法清蛋白檢測結(jié)果的偏差 見圖3。腎內(nèi)科患者血清樣本30例，比較兩種方法檢測結(jié)果的偏差，框中20例全部為腎病綜合征患者，BCG法高估清蛋白4～10 g/L。其余10例患者中僅1例為難治性腎病綜合征，其他為腎移植、腎炎、泌尿道感染、腎性高血壓等。

2.3 孕產(chǎn)婦BCG法與免疫比濁法清蛋白檢測結(jié)果的偏差 見圖4。妊娠中期和晚期樣本共36例，比較兩種方法檢測結(jié)果的偏差，除2例外，其余34例BCG法高估清蛋白2～5 g/L，當(dāng)血清清蛋白濃度小于30 g/L，偏差超過4 g/L。

圖3 腎內(nèi)科患者BCG法與免疫比濁法清蛋白檢測結(jié)果的偏差 圖4 孕產(chǎn)婦BCG法與免疫比濁法清蛋白檢測結(jié)果的偏差

2.4 新生兒BCG法與免疫比濁法清蛋白檢測結(jié)果的偏差 見圖5。新生兒樣本共36例，比較兩種方法檢測結(jié)果的偏差，新生兒血清清蛋白水平相對集中，主要在30～40g/L的區(qū)間內(nèi)，偏差則集中在±2 g/L范圍內(nèi)。

2.5 血液病患者BCG法與免疫比濁法清蛋白檢測結(jié)果的偏差 見圖6。血液病患者血清樣本31例，比較兩種方法檢測結(jié)果的偏差，框中8例BCG法高估清蛋白2～4 g/L，其中4例急性髓系白血病，2例干細(xì)胞移植狀態(tài)，2例急性淋巴細(xì)胞白血病。其余23例患者兩種方法檢測結(jié)果的偏差在±2 g/L范圍內(nèi)，全部為急性淋巴細(xì)胞白血病。

圖5 新生兒BCG法與免疫比濁法清蛋白檢測結(jié)果的偏差 圖6 血液病患者BCG法與免疫比濁法清蛋白檢測結(jié)果的偏差

3討論血清清蛋白檢測是臨床最常用的檢驗項目之一，溴甲酚綠染料法(BCG)清蛋白檢測已開展近50年。BCG與清蛋白可結(jié)合形成藍(lán)綠色化合物，在波長630 nm處有吸收峰，其吸光度與清蛋白濃度成正比。由于使用方便，價格低廉，在臨床實驗室中廣泛應(yīng)用，但也有著明顯的局限性。其檢測原理為正負(fù)電荷吸引作用，特異性差，BCG不僅與清蛋白反應(yīng)，還會與球蛋白、纖維蛋白原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等反應(yīng)，影響檢測結(jié)果。盡管將反應(yīng)時間控制在30 s內(nèi)進(jìn)行比色，可以減少“慢反應(yīng)”的干擾，但偏差依舊存在[15]。

從溯源性角度，美國國家標(biāo)準(zhǔn)和檢測研究院(national institute of standards and technology，NIST)公布的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，沒有人血清清蛋白，只有牛血清清蛋白(NIST SRM 927b)。1993年發(fā)布的歐洲共同體標(biāo)準(zhǔn)局參考物質(zhì)ERM-DA470k/IFCC(原CRM-470)中，含有的參考物質(zhì)包括了人血清清蛋白，但是，這是專門用于免疫比濁法測定的[13-14]。因此，盡管說人血清清蛋白可溯源至CRM-470，對于比色法而言不合適。

與免疫比濁法相比，本研究發(fā)現(xiàn)BCG法血清清蛋白檢測結(jié)果偏差與清蛋白濃度呈高度負(fù)相關(guān)。此與馮品寧等[16]報道一致，BCG法高估了清蛋白水平，正常值以下檢測結(jié)果偏高，濃度越低，偏差越大。在腎病綜合征、妊娠等患者中的偏差通常高于2 g/L。因此，對我院比較集中的幾類患者，包括腎內(nèi)科、孕婦、新生兒和血液病，兩種方法檢測血清清蛋白的偏差進(jìn)行了評估。結(jié)果表明BCG法明顯高估腎病綜合征患者血清清蛋白水平，而對其他腎內(nèi)科患者(包括腎移植、腎炎、泌尿道感染、腎性高血壓)的影響較小，這一方面與腎病綜合征患者清蛋白水平嚴(yán)重低于正常值有關(guān)，另一方面也與腎病綜合征患者血清α2-球蛋白、α2-巨球蛋白水平升高，非特異性反應(yīng)增加有關(guān)[11，17]。在評估的腎內(nèi)科30例患者中，約2/3的患者因BCG法檢測而掩蓋了其真實的病情，因此，推薦腎內(nèi)科患者采用更為精準(zhǔn)的免疫比濁法檢測血清清蛋白。

BCG法普遍高估孕婦血清清蛋白水平超過2 g/L，濃度越低，偏差越大，最高達(dá)29%，在評估的36例妊娠中晚期的孕婦中，約90%以上的婦女因BCG法檢測而掩蓋了其真實的營養(yǎng)狀況。因此，推薦孕婦特別是妊娠中晚期的母親應(yīng)采用免疫比濁法檢測血清清蛋白。對BCG法清蛋白濃度小于30 g/L的孕婦，增加免疫比濁法的評估，對妊娠并發(fā)腎臟損傷和子癇前期等患者的血清清蛋白水平正確評估。

同理，新生兒和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者兩種方法檢測血清清蛋白結(jié)果較一致。急性髓系白血病等其他血液病患者BCG法高估血清清蛋白水平，濃度越低，差異越大，因此，推薦BCG法清蛋白濃度小于30 g/L的血液病患者，增加免疫比濁法的評估。

因我院患者來源有限，本研究未能對肝臟纖維化和肝硬化等低蛋白血癥患者兩種方法血清清蛋白檢測的差異進(jìn)行評估，根據(jù)UCHIDA等[18]報道，推薦采用免疫比濁法檢測。

BCG法檢測血清清蛋白為多數(shù)封閉系統(tǒng)配套的檢測方法，其檢測成本低，精密度高，適用于大部分的患者。然而，在部分患者中可與球蛋白和急性時相蛋白非特異性結(jié)合而高估血清清蛋白水平。本研究為評價免疫比濁法血清清蛋白檢測在我院的適用患者，比較了BCG法與免疫比濁法血清清蛋白檢測結(jié)果的差異，發(fā)現(xiàn)在腎病綜合征、孕產(chǎn)婦和低蛋白血癥患者中，BCG法明顯高估血清清蛋白水平，因此，推薦此類患者采用免疫比濁法正確評估血清清蛋白濃度，以免BCG法結(jié)果對臨床的診斷、療效觀察和預(yù)后評估帶來誤導(dǎo)。臨床實驗室必須重視BCG法局限性，必要時采用免疫比濁法測定血清清蛋白濃度，為臨床提供更為精準(zhǔn)的評估手段。