HPLC-MS/MS法檢測血漿伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑濃度的方法建立及在白血病患者用藥監(jiān)測中的應(yīng)用*

王 磊，孫文利，劉 瑞，王紅春，劉紅星，2

(1.河北燕達陸道培醫(yī)院，河北三河 065201，2.北京陸道培血液病研究院，北京 100176)

關(guān)鍵字：伏立康唑；泊沙康唑；伊曲康唑；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；治療藥物監(jiān)測

白血病是一類造血干細胞的克隆性惡性疾病，免疫功能低下的患者容易受到真菌感染的侵襲[1-3]，而唑類抗真菌化合物[1-13](如伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑)在預(yù)防和治療這些真菌感染方面占有堅實的地位。伏立康唑主要用于治療侵襲性曲霉菌病或抗氟康唑念珠菌感染。泊沙康唑亦用于治療真菌感染或侵襲性曲霉菌病的搶救治療[6]。伊曲康唑?qū)η咕湍钪榫哂谢钚?，在預(yù)防真菌感染方面具有一定的地位。唑類抗真菌藥[4-11]的藥代動力學表現(xiàn)出較大的個體間和個體內(nèi)變異，部分原因可由非線性藥動學、生物利用度差異、藥物相互作用和細胞色素P450多態(tài)性所致。多年來，這種變異一直困惑著臨床。近期，有研究顯示患者血漿中唑類藥物濃度與療效和毒性之間有一定相關(guān)性[5-13]。為了常規(guī)監(jiān)測血漿中唑類抗真菌藥物的含量，需要一種通用的高通量樣品分析方法。目前尚無關(guān)于伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑商品化的血藥濃度檢測試劑盒。因此，我們建立了一種簡便、快速、靈活的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)分析患者血漿中此三種藥物的濃度，通過血藥濃度檢測以解決臨床在使用這三種藥物時所面臨的困境，讓臨床能更直觀的調(diào)整患者給藥劑量，達到更好地治療效果。

1材料與方法

1.1 研究對象 由于筆者所在醫(yī)院為血液病醫(yī)院，移植患者口服伏立康唑和泊沙康唑較多，故收集近期服用伏立康唑和泊沙康唑患者血漿樣本各1 000份，伊曲康唑患者血漿樣本3例；標本采集時間均為下次服藥前，采集靜脈血2 ml，混勻，EDTA抗凝。室溫(20～25℃)下標本存放時間不超過4 h，當日進行HPLC-MS/MS法檢測。

1.2 試劑和儀器 色譜甲醇(fisher)，水(廣州屈臣氏)；甲酸(HPLC Grade，MREDA TECHNOLOGY INC)；乙酸銨(HPLC Grade，MREDA TECHNOLOGY INC)；伏立康唑(中國食品藥品檢定研究院)；伏立康唑-d3，泊沙康唑，泊沙康唑-d4，伊曲康唑和伊曲康唑-d9均來自TORONTO RESEARCH CHEMICALS INC(HPLC Grade)。高效液相色譜系統(tǒng)(SHIMADZU，含二元LC-AD XR高壓輸液泵，DGU-20A3在線脫氣機，CTO-20A柱溫箱，SIL-20ACXR自動進樣器)；質(zhì)譜(AB Sciex 4000Qtrap)；數(shù)據(jù)分析處理軟件：Analyst V1.5.2工作站(AB公司)。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜及質(zhì)譜條件：見表1。

表1 質(zhì)譜條件

注：DP：declustering potential；CE：collision energy；CXP：collision cell exit potential；EP：entrance potential。

色譜條件：采用Ultimate XB-C18色譜柱(4.6×50 mm，5 μm)，柱溫60℃；流速：0.8 ml/min；流動相：0.1 ml/dl甲酸甲醇溶液(A)- 0.1 ml/dl甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液(B)，進樣量1 μl，洗脫方式：梯度洗脫，其中0.3～1.3 min，A相濃度為12%～82.5%，保持1.2～2.6min A相濃度從82.5%～100%，保持0.9～3.6min A相濃度從100%～12%，保持1.4 min停止。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)；離子極性：正離子模式；監(jiān)測模式為MRM；離子噴射電壓：4 500 V；溫度：500℃；GS1：55；GS2：55；Curtain gas：30；碰撞氣壓力：Medium。

1.3.2 標準品貯備液與內(nèi)標貯備液的配制：精密稱取標準品伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑各10 000 0 mg，分別置于小燒杯中，用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10.00 ml容量瓶中，用甲醇定容，得1.0 mg/ml伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑標準品母液，作為貯備液。分別移取各標準品貯備液適量，混合，再用甲醇-超純水(1/1)依次稀釋，分別得混合標準品濃度為1，5，10，25，50，75和100 μg/ml，作為1～7號系列混合標準工作液。精密稱取標準品伏立康唑-d3 0.5000 mg，泊沙康唑-d4 0.5000 mg和伊曲康唑-d9 1.000 0 mg分別置于三個小燒杯中，用適量甲醇溶解，分別轉(zhuǎn)移至三個10.00 ml容量瓶中，用甲醇定容，得50 μg/ml 伏立康唑-d3母液，50 μg/ml 泊沙康唑-d4和100 μg/ml 伊曲康唑-d9母液作為內(nèi)標貯備液，分別移取各內(nèi)標貯備液適量，配成濃度為伏立康唑-d3 5 ng/ml，泊沙康唑-d4 100 ng/ml和伊曲康唑-d9 200 ng/ml的混合內(nèi)標液，備用。

1.3.3 樣品處理方法：移取患者樣本血漿100 μl置于1.5 ml EP管中，然后加入0.1 ml/dl甲酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液100 μl，渦旋振蕩0.5 min，再加入混合內(nèi)標液800 μl，渦旋振蕩0.5 min，13 000 r/min，離心10 min，取上清液150 μl置于自動進樣器。

1.3.4 標準曲線的制備：分別在7個1.5 ml EP管中加入空白血漿90 μl，并加入含有伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑各系列混合標準工作液10 μl，得各標準品濃度分別為0.1，0.5，1，2.5，5，7.5和10μg/ml，按“1.3.3”項下樣品處理方法處理后進樣測定，分別以伏立康唑峰面積/伏立康唑-d3峰面積為(Y)對伏立康唑濃度(X)，泊沙康唑峰面積/泊沙康唑-d4峰面積為(Y)對泊沙康唑濃度(X)和伊曲康唑峰面積/伊曲康唑-d9峰面積為(Y)對伊曲康唑濃度(X)進行線性回歸，分別得伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑標準曲線。

1.3.5 回收率、精密度試驗：分別在3個1.5 ml EP管中加入空白血漿90 μl，并加入含有伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑2，3，5號混合標準工作液各10 μl，得各標準品濃度分別為0.5，1和5 μg/ml，按“1.3.3”項下樣品處理方法處理后進樣測定，各濃度日內(nèi)重復(fù)測定5次，計算相對回收率及日內(nèi)精密度，并連續(xù)測定5天，計算日間精密度。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗：分別在3個1.5 ml EP管中加入空白血漿90 μl，并加入含有伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑2，3，5號標準工作液各10 μl，得各標準品濃度分別為0.5，1和5 μg/ml。取一份樣品按“1.3.3”項下血樣處理方法處理后置于4℃自動進樣器中，于放置時間72 h分別測定各樣品的濃度；其余樣品于4℃冰箱中放置72 h后取出放至室溫，按“1.3.3”項下樣品處理方法處理后進樣測定，考察其穩(wěn)定性。

1.4 統(tǒng)計學分析 對伏立康唑和泊沙康唑血藥濃度檢測結(jié)果作四分位法分析。

2結(jié)果

2.1 色譜質(zhì)譜行為 在“1.3.1”項下的色譜質(zhì)譜條件下，測得伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑二級碎片離子質(zhì)譜圖，見圖1；其質(zhì)譜色譜圖見圖2。由圖2可見，血中沒有物質(zhì)干擾伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的測定，出峰時間分別是2.61，2.87和3.35 min；各物質(zhì)能實現(xiàn)較好分析，各峰型良好，無雜質(zhì)峰干擾。

2.2 標準曲線回歸方程 在“1.3.4”條件下，伏立康唑回歸方程為：Y=1.58X+0.011 6 (r=0.998 7)，泊沙康唑回歸方程為：Y=1.38X+0.021 7(r=0.998 2)和伊曲康唑回歸方程：Y=1.42X+0.032 5(r=0.999 1)，表明此三種物質(zhì)在濃度0.1～10.0 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系均較好，可用于血漿中此三種藥物的含量測定，最低定量限分別為0.009，0.021和0.085 μg/ml。

2.3 方法學評價結(jié)果 伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的相對回收率和日內(nèi)、日間精密度測定結(jié)果，見表2。由表2可知，伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑相對回收率均在±5%之間，日內(nèi)及日間精密度RSD均小于5%。說明此方法檢測血中伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑濃度精密度和準確度較好。

表2 回收率和精密度試驗結(jié)果

伏立康唑(A)，伏立康唑-d3(B)，泊沙康唑(C)，泊沙康唑-d4(D)，伊曲康唑(E)和伊曲康唑-d9(F)。

圖2 伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑質(zhì)譜色譜圖

2.4 穩(wěn)定性考察結(jié)果 見表3。在4℃條件下，血中伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑放置72 h濃度無變化；血樣經(jīng)過處理后，在4℃條件下，放置72 h，伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑濃度亦無變化。說明伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑在血中較穩(wěn)定，同時血漿樣本經(jīng)前處理后不會影響其穩(wěn)定性，可長時間放置，待檢。由此可知，在此條件下測定血中伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑濃度，穩(wěn)定性較好。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5 臨床應(yīng)用結(jié)果 白血病患者伏立康唑和泊沙康唑血藥濃度檢測結(jié)果做成箱式圖，可以得知1 000例伏立康唑樣本濃度檢測結(jié)果中位數(shù)是0.8 μg/ml，上四分位數(shù)是0.3 μg/ml，下四分位數(shù)是1.7 μg/ml，伏立康唑 0.1～10 μg/ml的檢測范圍符合臨床需求。1 000例泊沙康唑樣本濃度檢測結(jié)果的中位數(shù)是0.8 μg/ml，上四分位數(shù)是0.4 μg/ml，下四分位數(shù)是1.4 μg/ml，與泊沙康唑 0.1～10 μg/ml的檢測范圍相符合。

3討論本實驗采用混合內(nèi)標法，通過蛋白沉淀法進行甲醇沉淀蛋白和釋放伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑，使其充分溶解于甲醇。通過質(zhì)譜對其進行快速檢測，進而實時定量，能節(jié)約各藥物的定標時間和檢測各樣本平衡時間，能快速報告各藥物血藥濃度，輔助臨床盡早調(diào)整用藥，使患者得到適宜的個體化治療。

此1 000例伏立康唑血藥濃度檢測結(jié)果表明目前使用伏立康唑劑量偏小，濃度偏低，明顯低于伏立康唑有效谷濃度范圍0.5～5μg/ml[1-13]，說明白血病患者服用伏立康唑尚有一部分患者不能達到有效的預(yù)防和治療濃度，對其進行血藥濃度監(jiān)測具有重要的臨床意義。而1 000例泊沙康唑血藥濃度檢測結(jié)果表明目前使用泊沙康唑的劑量也較低，血藥濃度結(jié)果偏低，亦小于相關(guān)文獻報道[1-13]的有效谷濃度(>0.7 μg/ml)，其檢測結(jié)果中位數(shù)明顯低于理想靶值(1.25 μg/ml)，說明白血病患者在目前臨床給藥情況下，有相當一部分患者未能達到有效的治療濃度，足見對其進行血藥濃度監(jiān)測能更好地使患者得到治療，有效控制感染和避免感染的發(fā)生。而伊曲康唑目前臨床應(yīng)用較少，3例檢測數(shù)據(jù)表明，伊曲康唑在目前臨床給藥情況下，其血藥濃度尚可，其主要代謝產(chǎn)物羥基伊曲康唑[3-9]與原藥伊曲康唑的濃度比例為2∶1，且羥基伊曲康唑體外研究表明還有活性，體內(nèi)研究尚無完整數(shù)據(jù)可查。

目前國內(nèi)[3-7]對于抗真菌藥物的治療藥物監(jiān)測已經(jīng)有一些共識和具體建議，越來越多的國外[11-13]研究結(jié)果認為血漿藥物濃度監(jiān)測在抗真菌藥物的安全性和有效性優(yōu)化方面起到重要的作用；美國感染病學會(IDSA)關(guān)于曲霉菌病治療的臨床實踐指南中，建議結(jié)合血漿抗真菌藥物濃度和其他臨床評價指標來評估藥物暴露不足導致的治療失敗以及藥物毒性。