亞慢性銅暴露對背角無齒蚌鰓抗氧化系統(tǒng)的影響

林子根，井維鑫，王 蘭

（山西大學生命科學學院，太原 030006）

銅（Copper，Cu）是機體必需的微量元素之一[1]，是超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、細胞色素c氧化酶（Cytochrome c oxidase）、銅氧化酶（Ceruloplasmin）等許多抗氧化酶的輔因子，且具有促進機體造血、加快生長繁殖和增強機體免疫力的功能[2]。然而，過多的Cu可誘發(fā)機體產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS），引起生物膜損傷、蛋白質變性、酶失活及DNA突變[3-4]。

近年來，巢湖、太湖、鄱陽湖Cu污染均已達中度以上水平，其污染來源主要是采礦廢水、化肥施用等[5-7]。研究表明，Cu可通過呼吸、進食和體表滲透等途徑被水生動物吸收[1]，對水生動物的毒性較哺乳動物更大[8-9]。貝類被認為是監(jiān)測水體重金屬污染的理想指示生物[10-11]，其體內的抗氧化酶及小分子抗氧化劑可作為生物標志物用來監(jiān)測和評價水體Cu等重金屬的污染程度[12-15]。

背角無齒蚌（Anodonta woodiana）是在我國分布廣泛的淡水蚌，對Cu具有較強的富集能力[16]，曾作為指示生物用于太湖五里湖重金屬污染監(jiān)測評估[17]。然而，有關Cu對背角無齒蚌毒性的研究較少，且鰓是重金屬蓄積的重要靶器官[15]。因此，本研究通過檢測亞慢性Cu2+暴露后背角無齒蚌鰓中抗氧化指標，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）和谷胱甘肽轉硫酶（Glutathione S-transferase，GST）活性，還原型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量及總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）水平，篩選可指示Cu污染的合適的生物標志物，為背角無齒蚌用于淡水Cu污染監(jiān)測和評估提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用背角無齒蚌（以下簡稱“河蚌”）購自湖南省郴州市蘇仙區(qū)棲鳳渡鎮(zhèn)水產(chǎn)市場，將其置于盛有曝氣48 h以上自來水（pH 6.8，溶氧6.0～6.3 mg·L-1，水溫20±2℃）的塑料箱（長×寬×高為60 cm×42 cm×35 cm）中暫養(yǎng)3周，馴養(yǎng)期間每2 d換1次水，每日每只河蚌喂3.5×104個小球藻，并維持室溫20℃左右。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要儀器及試劑

儀器:高速冷凍離心機（Eppendorf，5804R型），電動勻漿儀（FLUKO，F(xiàn)6/10型），電熱恒溫水浴鍋（Eppendorf，HHS型），多功能酶標儀（SpectraMax M5型）。

試劑:氯化銅（CuCl2·2H2O，分析純）、氯化鈉（NaCl，分析純），蛋白定量測定試劑盒，SOD、CAT、GPx、GST測定試劑盒，GSH和MDA含量測定試劑盒，T-AOC測定試劑盒，均購于南京建成生物工程所。

1.2.2 實驗設計

稱取5.884 g CuCl2·2H2O于小燒杯中，加入200 mL雙蒸水充分溶解配制10 955 mg·L-1的Cu2+母液。根據(jù)Cu2+對河蚌96 h的LC50（109.55 mg·L-1）設置3個Cu2+（0.137、0.548、2.192 mg·L-1）暴露組和1個空白對照組，實驗共進行28 d。選取個體大小相近（殼長6.4±2.7 cm、殼寬4.0±1.7 cm、殼頂高2.2±2.0 cm）的河蚌分別置于4個塑料箱（長×寬×高為51 cm×35 cm×30 cm）中，每箱隨機投放20只，對照組加入20 L曝氣48 h以上的自來水，暴露組加入20 L不同濃度的Cu2+溶液。暴露期間與馴養(yǎng)期間飼養(yǎng)條件保持一致。定時檢查河蚌的死亡情況（本實驗期間河蚌死亡率為87.5%），并及時挑出死亡個體。每組設4個平行。

1.2.3 樣品制備

Cu2+暴露7、14、21、28 d后，每組隨機取4只河蚌置于冰上，迅速剖取其鰓組織約0.1 g（稱質量前用濾紙吸凈組織表面水分），置于離心管中，用液氮速凍后轉移至-80℃低溫冰箱待測。按質量∶體積為1∶4的比例加入預冷的生理鹽水，在冰上用電動勻漿器（FLUKO，F(xiàn)6/10型）制備勻漿，然后4℃下2800 r·min-1離心10 min，取其上清液暫置于冰上。

1.2.4 測定方法

用考馬斯亮藍法測定組織蛋白含量，羥胺法測定組織SOD活力，可見光法測定CAT活力，比色法測定GPx和GST活力，TBA法測定MDA含量，微板法測定GSH含量，F(xiàn)RAP法測定T-AOC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA），運用Duncan法比較各暴露組和對照組間的差異，組間不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。實驗結果均以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 Cu2+暴露對河蚌鰓SOD活性的影響

如圖1所示，隨著暴露時間的延長，各暴露組河蚌SOD活性均表現(xiàn)為“誘導-恢復-誘導”的變化趨勢。其中，低、中濃度組SOD活性在Cu2+暴露14 d以及高濃度組SOD活性在Cu2+暴露21 d時恢復到對照組水平。在Cu2+暴露28 d時，隨著Cu2+濃度的增加，SOD活性先升高后降低，且均顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.2 Cu2+暴露對河蚌鰓CAT活性的影響

由圖2可知，經(jīng)Cu2+暴露后，除高濃度組Cu2+暴露28 d CAT活性較對照組無顯著差異外，其余各組與對照組相比均被顯著抑制（P＜0.05）。從Cu2+暴露7 d到14 d，中濃度組CAT活性下降，從Cu2+暴露21 d到28 d，中濃度組CAT活性上升。

2.3 Cu2+暴露對河蚌鰓GPx活性的影響

由圖3可知，經(jīng)Cu2+暴露后，河蚌鰓GPx活性較對照組被顯著誘導（P＜0.05）。低、高濃度組GPx活性隨著暴露時間的延長呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，且各暴露組GPx活性均在Cu2+暴露28 d時達到最低，但仍顯著高于對照組（P＜0.05）。Cu2+暴露7、21、28 d時，中、高濃度組GPx活性較低濃度組均顯著降低（P＜0.05）。

圖1 Cu2+對背角無齒蚌鰓組織SOD活性的影響Figure 1 Effect of Cu2+on SOD activities in gills of A.woodiana

圖2 Cu2+對背角無齒蚌鰓組織CAT活性的影響Figure 2 Effect of Cu2+on CAT activities in gills of A.woodiana

2.4 Cu2+暴露對河蚌鰓GST活性的影響

如圖4所示，經(jīng)Cu2+暴露后，河蚌鰓GST活性較對照組被顯著誘導（P＜0.05）。隨著暴露時間的延長，低濃度組GST活性無顯著變化，中濃度組GST活性顯著降低，高濃度組GST活性先升高后降低，且中、高濃度組GST活性均在Cu2+暴露28 d時達到最低，但仍顯著高于對照組（P＜0.05）。Cu2+暴露21、28 d時，中、高濃度組GPx活性較低濃度組均顯著下降（P＜0.05）。

2.5 Cu2+暴露對河蚌鰓GSH含量的影響

由圖5可知，經(jīng)Cu2+暴露后，河蚌鰓GSH含量較對照組顯著降低（P＜0.05）。低、中濃度組GSH含量隨著暴露時間的延長均先升高后降低，且均在Cu2+暴露28 d時達到最低。Cu2+暴露7、21、28 d時，高濃度組GSH含量均顯著高于低濃度組（P＜0.05）。

2.6 Cu2+暴露對河蚌鰓T-AOC的影響

如圖6所示，Cu2+暴露14、21、28 d時，河蚌鰓TAOC較對照組均顯著升高（P＜0.05），且各暴露組TAOC隨著暴露時間的延長均有所上升。Cu2+暴露21、28 d時，隨著Cu2+濃度的增加，T-AOC均先升后降，但均顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖3 Cu2+對背角無齒蚌鰓組織GPx活性的影響Figure 3 Effect of Cu2+on GPx activities in gills of A.woodiana

圖4 Cu2+對背角無齒蚌鰓組織GST活性的影響Figure 4 Effect of Cu2+on GST activities in gills of A.woodiana

2.7 Cu2+暴露對河蚌鰓MDA含量的影響

由圖 7可知，Cu2+暴露 14、21、28 d時，河蚌鰓MDA含量較對照組均顯著升高（P＜0.05）。各暴露組MDA含量均隨著暴露時間的延長而上升。Cu2+暴露14、21、28 d時，高濃度組MDA含量較低、中濃度組均顯著升高（P＜0.05）。

圖5 Cu2+對背角無齒蚌鰓組織GSH含量的影響Figure 5 Effect of Cu2+on GSH content in gills of A.woodiana

圖6 Cu2+對背角無齒蚌鰓組織T-AOC的影響Figure 6 Effect of Cu2+on T-AOC in gills of A.woodiana

圖7 Cu2+對背角無齒蚌鰓組織MDA含量的影響Figure 7 Effect of Cu2+on MDA content in gills of A.woodiana

3 討論

SOD是生物體內重要的抗氧化酶，可清除生物體內超氧陰離子（Superoxide anion，O-·2）[18]。CAT是一種主要存在于生物線粒體和過氧化物酶體中富含巰基的氧化還原酶，可直接快速催化分解過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）轉化為水和氧氣[19]。兩者共同組成機體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線[20]。有研究報道，厚殼貽貝（Mytilus coruscus）和河蜆（Corbicula fluminea）經(jīng)Cu2+暴露后，其鰓SOD活性均被顯著誘導[21-22]。在本研究中，背角無齒蚌鰓SOD活性在Cu2+暴露下也被誘導，可能是因為進入鰓中的Cu2+誘發(fā)產(chǎn)生的O-2·促使SOD基因的表達上調，SOD蛋白的合成增加，酶活水平上升[23-24]。Cu2+暴露28 d時，各暴露組SOD活性均顯著高于對照組，但高濃度組SOD活性較中濃度組顯著降低，這與對葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulata）研究所得到的結果類似[25]?？赡苡捎谠陂L時間高濃度Cu2+暴露下，背角無齒蚌鰓中產(chǎn)生了大量金屬硫蛋白（Metallothionein，MT），MT可直接快速與Cu2+結合來解毒重金屬，使O-2·生成量減少，以O-2·為底物的SOD活性下降[26]，隨著暴露時間的延長，各暴露組SOD活性均呈現(xiàn)“誘導-恢復-誘導”的變化趨勢，表明Cu2+暴露期間，背角無齒蚌鰓中O-2·生成量處于波動狀態(tài)，受機體抗氧化系統(tǒng)動態(tài)調節(jié)。經(jīng)Cu2+暴露后，背角無齒蚌鰓CAT活性受到抑制，這與對厚殼貽貝的研究結果一致[21]。可能由于背角無齒蚌鰓中積蓄的Cu2+在參與機體內氧化還原反應（例如，芬頓反應）的過程中轉化為Cu+，而Cu+又可與H2O2反應生成羥自由基，使得機體H2O2的含量降低，由于底物濃度的降低，引起CAT活性下降[27-28]。隨著暴露時間的延長，中濃度組CAT活性先降后升，但均顯著低于對照組，這可能與中濃度組SOD活性變化有關。從Cu2+暴露7 d到14 d，中濃度組SOD活性下降，H2O2生成量的減少不足以為CAT提供底物，使CAT活性降低；從Cu2+暴露21 d到28 d，中濃度組SOD活性上升，H2O2生成量增加，CAT活性上升[26]。

GPx在H2O2存在的情況下，可促進H2O2與GSH反應生成水及氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）[29]。GST是機體內具有清除有機過氧化物和解毒雙重功能的酶，可催化某些外源有害物質的親電子基團與GSH的巰基偶聯(lián)，增強外源毒物疏水性，使其易于被分解排出體外，從而發(fā)揮解毒作用以保護機體細胞免受毒害[29-30]。GSH是機體內的非蛋白巰基化合物，具有清除自由基、解毒、維持紅細胞膜完整性等多種重要生理功能[31]。研究發(fā)現(xiàn)，河蜆及淡水貝Anodonta anatina經(jīng)Cu2+暴露后，其鰓GPx活性均被誘導[32-33]；菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）和翡翠貽貝（Perna viridis）經(jīng)Cu2+暴露后，其鰓GST活性均被誘導[34-35]。在本研究中，經(jīng)Cu2+暴露后，背角無齒蚌鰓GPx活性被顯著誘導，推測這可能是機體對CAT活性受到抑制作出代償性調節(jié)的表現(xiàn)[36]。背角無齒蚌鰓GST活性在Cu2+暴露下也被顯著誘導，可能由于在Cu2+刺激下，GST基因表達上調，GST蛋白合成量增加，酶活水平升高[37]，加快催化了Cu2+與GSH的巰基相結合，從而達到解毒目的[30-31]。然而，經(jīng)Cu2+暴露后，背角無齒蚌鰓GSH含量顯著降低，這與對背角無齒蚌進行急性鎘暴露實驗所得出的結果一致[38]。可能是因為GSH一方面在GPx的催化下還原H2O2，并在此過程中最終轉化為GSSG[29]，另一方面在GST催化下通過自身分子中的巰基或肽鍵等結構綁定結合重金屬，從而降低重金屬毒性[30-31]。GSH作為GPx和GST兩種酶的共同底物，在GPx和GST兩者活性均被顯著誘導的情況下被大量消耗。Cu2+暴露7、21、28 d，各暴露組GPx和GST活性均顯著高于對照組，GSH含量顯著低于對照組，高濃度組GPx和GST活性較低濃度組顯著降低而高濃度組GSH含量較低濃度組顯著上升，可能是因為當Cu2+濃度升高到超出機體調節(jié)能力范圍時，機體內ROS的產(chǎn)生與消除間的動態(tài)平衡被打破，ROS不斷增加，機體細胞毒性反應加重，酶合成受阻，GPx和GST兩者活性下降，GSH消耗減少，GSH 含量回升[27，31]。

T-AOC是衡量機體抗氧化酶系統(tǒng)與非酶促系統(tǒng)整體功能狀態(tài)的綜合性指標，表現(xiàn)為機體內各種抗氧化大分子、小分子和酶的總體水平[39-40]。本研究結果顯示，Cu2+暴露14、21、28 d，背角無齒蚌鰓T-AOC較對照組均顯著升高，且隨著暴露時間的延長，各暴露組T-AOC均有所上升，表明隨Cu2+暴露時間延長，背角無齒蚌鰓中產(chǎn)生較為劇烈的氧化應激反應，TAOC適應性增高[41]。在對美麗蚌（Lampsilis siliquoidea）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的研究中也得到了類似的結果[42-43]。

MDA是脂質過氧化的重要產(chǎn)物之一，其含量?？芍苯臃从硻C體脂質過氧化的程度，間接反映出細胞損傷的程度[44]。研究表明，ROS可攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質過氧化物，從而對細胞造成損傷[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+暴露14、21、28 d，背角無齒蚌鰓MDA含量較對照組均顯著升高，且隨Cu2+濃度增加和暴露時間延長，MDA含量逐漸上升，表現(xiàn)出明顯的“劑量-效應”和“時間-效應”關系，類似的結果在對紫貽貝（Mytilus galloprovinciali）和溝紋蛤仔（Ruditapes decussatus）的研究中也被發(fā)現(xiàn)[40，45]?？赡苡捎谠陂L時間高濃度Cu2+暴露下，背角無齒蚌鰓中ROS累積超過一定限度，盡管機體充分調動抗氧化系統(tǒng)來應對Cu2+引起的氧化脅迫，但仍不足以保護鰓免受氧化損傷，脂質過氧化程度加深。

4 結論

（1）亞慢性Cu2+暴露對背角無齒蚌鰓SOD、GPx、GST活性均有誘導作用，對CAT活性有抑制作用。背角無齒蚌鰓抗氧化系統(tǒng)在Cu2+暴露下被激活，但仍受到了氧化損傷。

（2）背角無齒蚌鰓中GPx、GST和GSH對Cu2+暴露響應最為靈敏，可以作為生物標志物用于水體Cu污染的監(jiān)測和評估。