蘿卜硫素對人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究

楊艷華， 梁麗琴

1.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 恩施 445000; 2.恩施市中心醫(yī)院消化內(nèi)科

在消化道惡性腫瘤中胃癌的發(fā)病率和死亡率較高，對人類的身體健康也造成嚴(yán)重威脅。胃癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中占第5位，而致死率則位于第3位[1-2]。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)我國每年新增40萬例胃癌患者，占世界總?cè)藬?shù)的4.2%，對我國醫(yī)療工作者、患者帶來沉重壓力[3-4]。雖然醫(yī)療科技不斷革新、腫瘤治療的手段不斷改進(jìn)，但胃癌患者死亡率仍然較高，其中5年存活率不到30%[5]。目前，化療是晚期胃癌患者主要的干預(yù)手段，然而化療藥物作用的有限性及帶來明顯的毒副作用嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[6]。尋找新的治療胃癌的藥物是當(dāng)前亟需解決的問題。蘿卜硫素(Sulforaphane)主要來源于十字花科蔬菜，屬于一種異硫氰酸酯類化合物[7]，前期研究已發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素能夠預(yù)防、延緩及改善腫瘤出現(xiàn)之前的病理改變，而且還表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性[8]。近期也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素對胃癌細(xì)胞增殖具有抑制作用[9]，但其作用機(jī)制還不明確。于是，本文體外研究了蘿卜硫素對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡、周期的影響，還探討了蘿卜硫素誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 藥物及試劑蘿卜硫素(杭州林格貝公司，批號：3602-41-37，純度≥98%)；DMEM高糖培養(yǎng)基及質(zhì)量濃度為2.5 g/L胰酶(卡邁舒生物公司)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號：110524)；CCK-8試劑盒(上海紀(jì)寧公司，批號：WH1175)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(BD公司，批號：KGA107)；BCA試劑盒(上海威奧生物科技有限公司，批號：WB0123)；SDS-PAGE試劑盒(武漢谷歌生物有限公司，批號：P1320)；兔抗人Notch1、Hes1、Bcl-2、Bax及β-actin單克隆一抗(美國Sigma公司)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(武漢谷歌生物科技有限公司)。

1.2 儀器150i型CO2培養(yǎng)箱、MSC1.2型生物安全柜(美國Thermo公司)；EnSpire多功能酶標(biāo)板分析儀(美國PerkinElmer公司)；Mini-protean TetraSystem型垂直電泳、ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(貝克曼公司)。

1.3 胃癌細(xì)胞株培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫，采用質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37 ℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2，采用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8檢測SGC-7901細(xì)胞增殖把對數(shù)期細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液(5×104ml-1)后，接種至96孔板中，每孔200 μl。細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，每孔加入含不同濃度(0、15、30、60、100 μg/ml)蘿卜硫素的培養(yǎng)液200 μl，對照組加入等量的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24、48、72 h后，加入CCK-8溶液10 μl反應(yīng)2 h后，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-藥物組(A)/對照組(A)×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測SGC-7901細(xì)胞周期把對數(shù)期細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液(2×105ml-1)后，接種至6孔板中培養(yǎng)24 h后，加入含不同濃度(0、30、60 μg/ml)蘿卜硫素的培養(yǎng)液2 ml，24 h后吸去培養(yǎng)液上清，PBS清洗2次，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集細(xì)胞。PBS清洗2次后，在70%冷乙醇固定后進(jìn)行碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測SGC-7901細(xì)胞凋亡按照“1.5”項(xiàng)處理細(xì)胞后，將細(xì)胞收集至離心管中，PBS清洗2次，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞后進(jìn)行Annexin V-FITC/PI雙染色。具體操作如下：首先在避光環(huán)境下加入Annexin V-FITC染料孵育15 min，在同一條件下加入PI染料孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.7 Western blotting檢測SGC-7901細(xì)胞中Notch1、Hes1、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)按照“1.5”項(xiàng)處理細(xì)胞后，將細(xì)胞收集于冰上裂解30 min，15 000 r/min、4 ℃條件下離心12 min，取上清，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每孔上樣50 μg進(jìn)行凝膠電泳(電壓70 V，電泳3 h)，轉(zhuǎn)膜條件為恒流275 mA、80 min。質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂牛奶封閉膜1 h，加入一抗溶液(稀釋比1∶1 000)，采用TBST洗膜3次后室溫下加入二抗溶液(稀釋比1∶3 000)反應(yīng)1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL顯色后進(jìn)行曝光。

2 結(jié)果

2.1 蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響采用不同劑量(0、5、15、30、60、100 μg/ml)的蘿卜硫素干預(yù)SGC-7901細(xì)胞24、48、72 h后，對細(xì)胞增殖抑制率檢測結(jié)果如圖1所示。相同時間范圍內(nèi)，不同劑量的蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率隨劑量升高而增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在同一劑量的蘿卜硫素，對SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制活性隨時間延長而增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞周期的影響采用流式細(xì)胞儀分析SGC-7901細(xì)胞在不同劑量的蘿卜硫素干預(yù)24 h后細(xì)胞周期的情況。結(jié)果提示，0、30、60 μg/ml的蘿卜硫素干預(yù)24 h后處于G1期細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)出劑量依賴性(見圖2、表1)。

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響采用流式細(xì)胞儀分析SGC-7901細(xì)胞在不同劑量的蘿卜硫素干預(yù)24 h后細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0、30、60 μg/ml的蘿卜硫素干預(yù)24 h后SGC-7901細(xì)胞凋亡率分別為(2.43±0.07)%、(18.5±2.3)%和(33.7±2.6)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3)。

圖2 蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞周期的影響 Fig 2 Effect of Sulforaphane on the cell cycle of SGC-7901 cells

圖3 蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 Fig 3 Effect of Sulforaphane on the apoptosis of SGC-7901 cells

2.4 蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞中Notch信號通路的影響采用Western blotting方法檢測了SGC-7901細(xì)胞中Notch信號通路相關(guān)蛋白。結(jié)果提示，0、30、60 μg/ml的蘿卜硫素干預(yù)SGC-7901細(xì)胞24 h后，Notch1、Hes1及Bcl-2蛋白表達(dá)水平隨著蘿卜硫素劑量升高而降低，而Bax表達(dá)水平隨蘿卜硫素劑量升高而升高，Bcl-2/Bax比例降低，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖4、表2)。

圖4 蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞Notch信號通路的影響 Fig 4 Effect of Sulforaphane on the Notch pathway of SGC-7901 cells

分組Notch1Hes1BaxBcl-2對照組0.52±0.050.28±0.040.14±0.020.34±0.0330 μg/ml蘿卜硫素0.33±0.04?0.11±0.02?0.26±0.03?0.23±0.03?60 μg/ml蘿卜硫素0.16±0.02?0.06±0.01?0.44±0.04?0.07±0.01?

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

胃癌對人類健康帶來嚴(yán)重威脅，但治療胃癌的藥物療效非常有限，主要包括鉑類及氟尿嘧啶類藥物、紫杉醇類藥物及基因靶向藥物等[10]。有研究提出，蘿卜硫素對胃癌細(xì)胞增殖具有抑制作用，有望成為胃癌的輔助藥物[9]。由于多種抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)觀察蘿卜硫素對胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡及分裂周期的影響，并對其作用的分子機(jī)制進(jìn)行初探。

采用不同劑量的蘿卜硫素(0、30、60 μg/ml)干預(yù)SGC-7901細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞的抑制活性隨著劑量升高而增高；在同一劑量下，隨著作用時間延長，蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞的抑制活性隨之增強(qiáng)?？梢缘贸鎏}卜硫素對胃癌SGC-7901細(xì)胞有明顯的抑制作用，還表現(xiàn)出劑量和時間依賴性。進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀分析蘿卜硫素對SGC-7901細(xì)胞周期和凋亡率的影響，發(fā)現(xiàn)藥物處理細(xì)胞24 h后，蘿卜硫素表現(xiàn)出對SGC-7901細(xì)胞凋亡具有顯著的誘導(dǎo)作用，主要誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。

Notch信號通路在遺傳進(jìn)化上高度保守，參與介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程，并與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，具有促癌或抑癌作用[11]。在正常黏膜中不僅有Notch蛋白的表達(dá)，其通路中相關(guān)分子還參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展[12]。早期研究報道Notch信號過度激活能夠促使胃癌的惡化，而對其進(jìn)行抑制則會改善胃癌的癥狀[13]。本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，蘿卜硫素能夠抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞中Notch信號通路Notch1及下游靶基因Hes1蛋白的表達(dá)。Notch信號通路的活化能夠?qū)е孪掠蔚蛲鱿嚓P(guān)蛋白表達(dá)的改變，包括促凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2[14]。其中，作為一種抗凋亡相關(guān)蛋白，Bcl-2的高表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡；而Bax是一種同屬于Bcl-2家族的促凋亡相關(guān)蛋白，Bax的高表達(dá)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[15]。Bcl-2與Bax在細(xì)胞內(nèi)能夠相互作用形成復(fù)合物，進(jìn)而相互制約彼此發(fā)揮對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，于是Bcl-2與Bax比例影響著腫瘤細(xì)胞凋亡的走向。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素能夠抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)、誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，進(jìn)而降低了Bcl-2/Bax比例，促使胃癌細(xì)胞向凋亡方向發(fā)展。早期也有研究報道蘿卜硫素能夠上調(diào)Bax蛋白表達(dá)、抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比例，進(jìn)而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡[16]?？傊?，蘿卜硫素可以明顯誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡，可能通過抑制Notch1/Hes1信號通路、降低Bcl-2/Bax比例實(shí)現(xiàn)。