天山堇菜秦皮乙素大孔樹脂分離純化工藝優(yōu)化

趙麗娟 - 李 倩 李晨陽 - 徐 芳 趙 軍

(1. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2. 新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830004)

天山堇菜是堇菜科堇菜屬多年生草本植物，以全草入藥，主要分布于海拔3 000 m以上的天山山區(qū)[1-2]。該藥材可水煎或泡茶使用，氣味微苦，具有清熱祛風(fēng)、解毒消腫的療效，主要用于發(fā)燒、頭痛、咽痛、小兒驚厥等疾病的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[3]表明天山堇菜具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等多種生物活性，其化學(xué)成分包含香豆素、黃酮、生物堿、皂苷和揮發(fā)油等，其中秦皮乙素是其主要的標(biāo)識性成分。秦皮乙素又名七葉內(nèi)酯、6,7-二羥基香豆素，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和保肝等多種生物活性[4]。對天山堇菜秦皮乙素的研究僅限于其含量測定及抗腫瘤活性篩選研究[3,5]，其提取純化工藝尚未見報道。大孔樹脂具有吸附容量大、吸附速度快、再生簡便等優(yōu)點，被廣泛用于醫(yī)藥食品行業(yè)中有效成分純化中[6-8]。因此，為了天山堇菜及其成分秦皮乙素的開發(fā)，本試驗擬以秦皮乙素含量為指標(biāo)，建立天山堇菜秦皮乙素大孔樹脂純化工藝，以獲得富含秦皮乙素的提取物，同時分析其吸附動力學(xué)和熱力學(xué)特征，為天山堇菜進一步研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天山堇菜：批號160601，亳州市華云中藥飲片有限公司；

秦皮乙素對照品：批號110741-201708，中國食品藥品檢定研究院；

HPD100A、HPD400、HPD500、HPD750、NKA、X-5、D101、AB-8型大孔吸附樹脂：天津南開大學(xué)化學(xué)廠；

甲醇：色譜純，美國Fisher公司；

其他試劑：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：LC-10ATvp型，日本島津公司；

電子天平：AL204型，美國梅特勒—托利多儀器有限公司；

超聲清洗機：AS10200AD型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

小型粉碎機：ST-02A型，永康市帥同工具有限公司；

水浴恒溫振蕩器：SHA-B型，金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 天山堇菜提取液的制備 準(zhǔn)確稱取石油醚脫脂粉碎后的天山堇菜藥材360 g，以30倍量95%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濃縮至無醇味，用水反復(fù)混懸溶解過濾，濾液定容至600 mL，即得樣品溶液，測定秦皮乙素的濃度，備用。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取秦皮乙素對照品0.008 6 g，加甲醇溶解并定容至50 mL，即得濃度為0.172 0 mg/mL 的對照品溶液。

1.3.3 樹脂的預(yù)處理 稱取HPD100A、HPD400、HPD500、HPD750、NKA、X-5、D101和AB-8型樹脂適量，加入95%乙醇，浸泡24 h，裝柱，梯度乙醇洗脫至洗脫液和水混合不出現(xiàn)白色渾濁為止，用蒸餾水洗至無醇味，備用。

1.3.4 天山堇菜秦皮乙素的測定 色譜柱：Phenomenex Gemini-NX C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1% 磷酸水溶液—甲醇(體積比70∶30)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長258 nm；進樣量10 μL。精密量取對照品溶液0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容，搖勻后HPLC測定，以峰面積對秦皮乙素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=14 955X+14 853，r=0.999 5，線性范圍3.44～137.60 μg/mL。

1.3.5 不同型號樹脂的篩選 分別稱取0.5 g處理好的各種型號樹脂于25 mL具塞錐形瓶中，加入供試品溶液稀釋成0.206 8 mg/mL的溶液10 mL，25 ℃水浴恒溫振蕩器(頻率為120 r/min)中振搖吸附24 h，過濾，各取10 μL 按1.3.4測定秦皮乙素濃度。抽干樹脂表面水分，加入95%乙醇溶液10 mL，相同條件下振搖24 h，各取10 μL 測定秦皮乙素含量，分別按式(1)、(2)計算吸附率和解吸率。

(1)

(2)

式中：

R1——吸附率，%；

R2——解析率，%；

C0——吸附前秦皮乙素濃度，mg/mL；

C1——吸附后秦皮乙素濃度，mg/mL；

C2——解析液中秦皮乙素濃度，mg/mL；

V1——樣液體積，mL；

V2——解析液體積，mL。

大孔樹脂的特性如表1。

1.3.6 靜態(tài)吸附動力學(xué)試驗 稱取最佳樹脂5.0 g于250 mL 具塞錐形瓶中，加入供試品溶液稀釋成0.103 4 mg/mL 的溶液100 mL后，置于120 r/min，溫度298 K恒溫振蕩器中振蕩吸附12 h。分別于0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0，12.0 h吸取0.5 mL上清液，并通過HPLC測定秦皮乙素濃度，按式(3)計算樹脂的吸附量，并繪制HPD500對秦皮乙素的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

(3)

表1 大孔吸附樹脂的物理性質(zhì)

式中：

R3——吸附量，mg/g；

C0——吸附前秦皮乙素濃度，mg/mL；

C1——吸附后秦皮乙素濃度，mg/mL；

V1——樣液體積，mL；

m——樹脂質(zhì)量，g。

1.3.7 吸附等溫線和吸附熱力學(xué) 分別稱取最佳樹脂0.5 g 置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入10 mL濃度為0.051 7，0.103 4，0.155 1，0.206 8，0.258 5，0.310 2，0.361 9，0.413 6 mg/mL系列溶液，分別在298，308，318 K 恒溫振蕩器中以120 r/min振搖24 h，使其達到吸附平衡，測得不同溫度下的吸附等溫線，并計算樣品的平衡濃度、大孔樹脂的平衡吸附量。

1.3.8 大孔樹脂的動態(tài)吸附與解析試驗

(1) 上樣濃度的影響：分別稱取5份HPD500樹脂10.0 g裝入玻璃柱(φ20 mm×500 mm)(各因素考察均以此法裝柱)，以2.0 mL/min的流速各加入濃度為0.866 2(50 mL)，1.732 5(25 mL)，2.593 5(16.7 mL)，3.464 9(12.5 mL)，4.331 2(10 mL) mg/mL的提取液，用7 BV水洗脫，測定秦皮乙素含量并計算吸附量。

(2) 最大上樣量的選擇：以2.0 mL/min的流速將濃度為2.593 5 mg/mL樣液緩緩加入樹脂柱中，每10 mL收集一流份，測定流出液中秦皮乙素的含量，以考察樹脂的最大吸附量。

(3) 上樣流速的確定：以1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/min的流速分別加入2.593 5 mg/mL樣液30 mL，用7 BV水洗脫，測定秦皮乙素含量并計算吸附量。

(4) 除雜用水量的確定：以2.0 mL/min的流速分別加入2.593 5 mg/mL溶液30 mL充分吸附，用水洗脫除雜，每一柱體積收集一流份，濃縮干燥，稱重。

(5) 洗脫劑濃度的確定：以2.0 mL/min的流速分別加入濃度為2.593 5 mg/mL溶液30 mL，上樣完成后，用7 BV蒸餾水除雜，再以10%，30%，50%，70%，95%乙醇洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮干燥，按式(4)、(5)計算純度和回收率。

(4)

(5)

式中：

R4——回收率，%；

R5——純度，%；

M1——洗脫液中秦皮乙素含量，mg；

M2——上樣液中秦皮乙素含量，mg；

M3——濃縮干燥后質(zhì)量，g。

(6) 洗脫劑用量的確定：以2.0 mL/min的流速分別加入濃度為2.593 5 mg/mL溶液30 mL，用7 BV蒸餾水除雜，再以50%乙醇洗脫，每一個柱體積收集一個流份，測定含量，繪制洗脫曲線。

(7) 洗脫流速的確定：以2.0 mL/min的流速分別加入濃度為2.593 5 mg/mL溶液30 mL，用7 BV蒸餾水洗脫除雜，再用7 BV 50%乙醇以1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/min流速洗脫，測定含量，計算回收率。

(8) 驗證實驗：按最佳條件以2.0 mL/min的流速分別加入濃度為2.593 5 mg/mL樣液30 mL，平行3份，然后用7 BV蒸餾水除雜，再用7 BV 50%乙醇以2.0 mL/min流速洗脫，收集50%乙醇洗脫液，計算回收率和純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同型號大孔樹脂的篩選

樹脂的吸附量受被吸附物質(zhì)的特性、樹脂的比表面積、孔結(jié)構(gòu)及極性等因素影響?？讖叫〉臉渲欣谖椒肿淤|(zhì)量較小的物質(zhì)，HPD500樹脂孔徑5.5～7.5 nm，在所篩選8種樹脂中最小，秦皮乙素為小分子化合物(相對分子量為178.14)。由表2可知，HPD500樹脂對天山堇菜秦皮乙素有較好的吸附與解吸附效果，吸附率和解吸率分別達到了87.76%，86.82%。因此，選擇HPD500樹脂為該化合物純化的最佳樹脂。

表2 不同型號大孔樹脂對秦皮乙素的吸附與解吸附情況

2.2 靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

溶質(zhì)在溶液體系中進行吸附時，溶劑、溶質(zhì)對吸附劑進行競爭，假設(shè)溶劑的吸附可忽略時，吸附體系可用單組分吸附來處理。靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線顯示了吸附劑對溶質(zhì)的吸附量隨時間的變化過程[9]。如圖1所示，5 h內(nèi)HPD500樹脂的吸附量不斷增加；5 h后，HPD500樹脂的吸附量已基本保持平衡。因此，HPD500樹脂對天山堇菜秦皮乙素的吸附時間為5 h。

2.3 HPD500樹脂對秦皮乙素的吸附動力學(xué)模型

大孔樹脂對有效成分的吸附為物理過程，主要通過范德華力或者氫鍵進行。為闡明吸附機理，分別將擬一級、擬二級動力學(xué)模型應(yīng)用于結(jié)果的分析討論中[10]。

圖1 298 K時HPD500樹脂對秦皮乙素的靜態(tài) 吸附動力學(xué)曲線

擬一級動力學(xué)模型的表達式：ln(qe-qt)=lnqe-k1t，

(6)

通過取對數(shù)變換為qt=qe(1-e-k1t)，

(7)

(8)

式中：

qt——某一時間的吸附量，mg/g；

qe——平衡吸附量，mg/g；

k1——擬一級動力學(xué)模型的速率常數(shù)；

k2——擬二級動力學(xué)模型的速率常數(shù)。

以qt為縱坐標(biāo)對t作圖，可判斷反應(yīng)是否符合擬一級動力學(xué)規(guī)律并求得反應(yīng)系數(shù)k1。

以t/qt對t作圖，可判斷反應(yīng)是否符合擬二級動力學(xué)規(guī)律并求得反應(yīng)系數(shù)k2。

由表3可知，擬二級動力學(xué)方程能更好地描述HPD500樹脂對秦皮乙素的吸附過程，相關(guān)系數(shù)R2為0.999。

進一步用粒子擴散動力學(xué)Kannan方程(qt=k3t0.5+C，式中k3，C為常數(shù))分析結(jié)果，以t0.5為橫坐標(biāo)，qt為縱坐標(biāo)，擬合動力學(xué)試驗數(shù)據(jù)[11]。由表3可知，粒子擴散動力學(xué)Kannan方程不適合描述整個吸附過程，吸附速率的控制步驟除顆粒內(nèi)擴散外，可能還存在邊界層擴散和液膜擴散等其他吸附作用。

表3 HPD500型大孔樹脂對秦皮乙素吸附量的動力學(xué)參數(shù)

2.4 靜態(tài)吸附熱力學(xué)考察

由圖2可知，隨著秦皮乙素質(zhì)量濃度增加，吸附等溫線逐漸趨于平緩。隨著溫度的升高，qe降低，表明低溫有利于吸附，HPD500樹脂吸附秦皮乙素是個放熱過程。

等溫吸附模型的擬合常用Langmuir和Freundlich方程[12]。Langmuir模型為單分子層吸附過程，假定吸附劑的表面分布是均勻的、且吸附物之間無相互作用，該模型比較適合解釋單層吸附，即吸附作用僅發(fā)生在吸附劑的外表面。Freundlich模型不僅能用于單層吸附，還能用于不均勻表面的吸附情況，能很好地解釋試驗結(jié)果。

圖2 HPD500型大孔吸附樹脂對秦皮乙素的 吸附等溫線

(9)

(10)

式中：

qe——平衡吸附量，mg/g；

Ce——平衡濃度，mg/mL；

qm——飽和吸附量，mg/g；

KL——Langmuir常量；

KF、n——Freundlich常數(shù)。

由表4可知，隨著溫度的升高，KF，KL，qm都降低，表明此吸附為放熱過程，低溫有利于吸附。Freundlich方程的相關(guān)系數(shù)R2接近于1，說明HPD500樹脂對秦皮乙素的等溫吸附更符合該方程，也說明秦皮乙素在HPD500上的吸附是非均勻的多層吸附。n>1，說明該吸附為“優(yōu)惠吸附”，具有較強的吸附能力。

2.5 吸附熱力學(xué)參數(shù)的計算

吸附熱力學(xué)參數(shù)包括吸附焓變(△H)、吸附自由能變(△G)和吸附熵變(△S)。按文獻[13-14]的方法計算熱力學(xué)參數(shù)。等量吸附焓變△H和樹脂吸附量有密切關(guān)系，Van’t Hoff方程：

表4 兩個方程擬合參數(shù)

ln(1/Ce)=lnK0+(-△H/RT)，

(11)

式中：

K0——Van’t Hoff方程常數(shù)；

R——理想氣體常數(shù)8.314 J/(mol·K)。

△H按式(11)計算，以ln(1/Ce)對1/T作圖，通過擬合方程計算△H。

吸附自由能△G可通過Gibbs方程從吸附等溫線衍生計算得式(12)：

(12)

式中：

q——吸附量，mg/g；

x——溶液中吸附質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)。

(13)

將式(13)代入式(12)得式(14)：

△G=-nRT，

(14)

式中：

n——Freundlich方程中的參數(shù)。

說明△G與吸附量q無關(guān)。

吸附熵△S按式(15)算：

Gibbs-Helmholtz方程：△S=(△H-△G)/T。

(15)

由表5可知，不同初始濃度下的△H均<0，表明吸附為放熱過程，與吸附等溫線得出的結(jié)論一致。△G均<0，說明樹脂吸附秦皮乙素是自發(fā)的，且隨溫度的升高，△G逐漸增大，自發(fā)程度減小，升溫不利于吸附。△G和△H的絕對值分別<20、40 kJ/mol，說明吸附為物理過程[15-16]。△S始終<0，說明吸附后溶液體系的混亂程度降低，可能由于溶質(zhì)分子被吸附到樹脂表面上而導(dǎo)致溶質(zhì)分子在溶液中的自由度降低。

2.6 大孔樹脂動態(tài)吸附與解析

2.6.1 單因素試驗 由圖3(a)可知，當(dāng)上樣濃度<2.593 5 mg/mL時，隨濃度的增大，吸附量逐漸增加；超過2.593 5 mg/mL時，吸附量下降。因此，選擇最適的上樣濃度為2.593 5 mg/mL。由圖3(b)可知，當(dāng)上樣體積為30 mL(即兩個柱體積，2 BV)時，有少量的秦皮乙素泄漏，

表5 HPD500樹脂吸附秦皮乙素的熱力學(xué)參數(shù)

圖3 大孔樹脂動態(tài)試驗結(jié)果

超過30 mL，出現(xiàn)大量泄漏。通過換算，確定最大上樣量為7.780 5 mg/g·樹脂。如圖3(c)所示，隨著流速的增大，吸附量不斷降低，秦皮乙素未被吸附就洗脫。上樣流速小，化合物能被樹脂充分地吸附。考慮時間成本因素，選擇上樣流速為2.0 mL/min。由圖3(d)可知，除雜用水量增加，所得雜質(zhì)的質(zhì)量明顯減少；達到7 BV時，雜質(zhì)的質(zhì)量變化很小，絕大部分雜質(zhì)已被洗脫下來。故選取7倍量的蒸餾水除雜。由圖3(e)可知，乙醇濃度越高，回收率較高，可能是由于秦皮乙素分子量小，脂溶性較大。乙醇濃度>50%時，其濃度越高，洗脫下的雜質(zhì)越多，純度也越低。故洗脫溶劑確定為50%乙醇。由圖3(f)可知，7 BV 的50%乙醇溶液可將秦皮乙素幾乎全部洗脫下來。故選擇7 BV的50%乙醇洗脫。如圖3(g)所示，洗脫流速過快，越不利于秦皮乙素的洗脫，其回收率逐漸減小。因此，選取2.0 mL/min為洗脫流速。

2.6.2 驗證實驗 在最佳條件下，秦皮乙素的平均回收率為93.32%，RSD為1.20%；平均純度為37.16%，RSD為0.56%，說明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

HPD500樹脂對秦皮乙素具有較高的吸附率和解吸附率；吸附過程符合Freundlich等溫方程，降溫有利于吸附；吸附是一個自發(fā)(G<0)、放熱(H<0)的物理過程。熵變S<0，表明吸附為熵減的過程；吸附動力學(xué)符合擬二級動力學(xué)方程，相關(guān)系數(shù)為0.999，能有效反映HPD500樹脂對秦皮乙素的吸附過程。動態(tài)試驗結(jié)果顯示，天山堇菜秦皮乙素上樣濃度2.593 5 mg/mL，最大上樣量7.780 5 mg/g·樹脂，上樣流速2.0 mL/min，除雜水量7 BV，7 BV 50%乙醇溶液洗脫，洗脫流速2.0 mL/min時，解吸率可達93.32%，所得提取物中秦皮乙素含量由上樣前的0.90%提高到37.16%，提高了41倍。以上試驗結(jié)果表明，該工藝成本低、簡單易操作，適用于天山堇菜秦皮乙素的工業(yè)化大生產(chǎn)。后續(xù)可通過各種色譜技術(shù)進一步探索建立從提取物中獲得高純度秦皮乙素的純化方法。