UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定紅糖中9種雌性激素

韓 智 王會(huì)霞 - 龔 蕾 朱曉玲 -曹 琦 王 彬 張 苗ZG

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430070；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

紅糖富含氨基酸、多酚類(lèi)化合物、有機(jī)酸及微量元素，具有益氣養(yǎng)血、健脾暖胃、祛風(fēng)散寒、活血化瘀等功效，深受中國(guó)人群特別是女性和老年人的青睞[1]。2016年，“新余市糖姑娘貿(mào)易有限公司疑似非法添加雌激素”事件把紅糖的食品安全推向風(fēng)頭浪尖[2]，暴露出食糖存在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。雌性激素對(duì)維持女性正常生殖功能十分重要，具有促進(jìn)性器官發(fā)育的功能，還能促進(jìn)第二性征發(fā)育等。紅糖中添加雌性激素可能有緩解痛經(jīng)等功能，但有研究[3-4]表明過(guò)多的激素進(jìn)入人體內(nèi)可能引起內(nèi)分泌失調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，甚至導(dǎo)致腫瘤等疾病。歐盟等國(guó)際組織及國(guó)家均對(duì)動(dòng)物源性食品中激素的殘留作出了嚴(yán)格的要求，中國(guó)也有相關(guān)法律法規(guī)[5]禁止一些激素在動(dòng)物性食品中檢出。

近年來(lái)，激素的檢測(cè)技術(shù)得到國(guó)內(nèi)外研究者的普遍關(guān)注，開(kāi)發(fā)出的檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高、檢出限低，目前食品中激素殘留的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，GC-MS或HPLC分離一般需要衍生處理，過(guò)程較為繁瑣，激素具有沸點(diǎn)高、揮發(fā)性低的特點(diǎn)，一般不宜采用GC-MS法直接測(cè)定[6]。LC-MS/MS是目前激素檢測(cè)的主要方法，相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也采用LC-MS/MS法，如GB/T 21981—2008、SN/T 1980—2007、SN/T 2533—2010，檢測(cè)對(duì)象為動(dòng)物性食品及化妝品。而以食糖基質(zhì)為分析對(duì)象的相關(guān)研究少有報(bào)道，在“糖姑娘”[2]事件發(fā)生后，曾三妹等[6]利用LC-MS/MS檢測(cè)食糖中的雌二醇，樣品經(jīng)水溶解后，用堿化乙腈提取，經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，HPLC-MS/MS檢測(cè)，雌二醇定量限為0.1 μg/kg。高裕鋒等[7]用乙腈提取紅糖樣品中的雌二醇，經(jīng)QuEChERs方法凈化，用HPLC-MS/MS檢測(cè)，雌二醇的檢出限為0.7 μg/kg。這些檢測(cè)方法的建立為食糖的食品安全監(jiān)管工作的開(kāi)展提供一定的技術(shù)支持。相比于食糖基質(zhì)，肝腎組織[8]、水體[9-10]、水產(chǎn)[11]、飼料[12]、乳制品[13-14]等基質(zhì)已開(kāi)發(fā)出同時(shí)檢測(cè)多激素殘留的方法，但食糖中僅有雌二醇的檢測(cè)方法。紅糖作為一款熱銷(xiāo)產(chǎn)品，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，但其安全問(wèn)題不容忽視，特別是非法添加雌性激素問(wèn)題值得關(guān)注。

本試驗(yàn)擬對(duì)紅糖中可能非法添加的9種雌性激素為研究對(duì)象，包括4種雌激素(雌酮、己烯雌酚、雌二醇、雌三醇)，5種孕激素(醋酸甲羥孕酮、甲孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、孕酮)，建立同時(shí)檢測(cè)這9種物質(zhì)的方法，對(duì)已有檢測(cè)方法進(jìn)行有效補(bǔ)充，旨在完善激素殘留檢測(cè)體系，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)，以期為食糖安全生產(chǎn)和健康風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌酮(99.5%)、己烯雌酚(99.5%)、雌二醇(96.6%)、雌三醇(98.8%)、孕酮(99.2%)、甲孕酮(99.0%)、醋酸氯地孕酮(99.6%)、醋酸甲地孕酮(99.0%)、醋酸甲羥孕酮(99.0%)：德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；

甲醇、乙腈：HPLC級(jí)，美國(guó)Merck公司；

乙酸銨：HPLC級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：Qtrap 6500型，美國(guó)ABSCIEX公司；

超高效色譜儀：Ultimate 3000型，美國(guó)Thermo Fisher公司；

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3型，100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)Waters公司；

超純水器：Milli-Q型，法國(guó)密理博公司；

孔徑濾膜：0.22 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

渦旋振蕩器：YALBOYS型，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

高速離心機(jī)：Avanti JXN 30 型，美國(guó)Beckman Coulter公司；

HLB固相萃取柱：60 mg，3 mL，美國(guó)Waters公司；

電子天平：ME204型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

氮吹儀：N-EVAP 116型，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 相關(guān)溶液的配制

(1) 2 mmol/L乙酸銨溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.154 0 g乙酸銨，用超純水溶解，并定容至1 L。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：孕酮、甲孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、己烯雌酚用乙腈溶解并定容，配制成濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；雌二醇、雌三醇、雌酮先用少許二甲亞砜溶解，再用乙腈定容至刻度，配制成濃度為 1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)需要用50%乙腈—水溶液稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液均在-18 ℃冰箱中保存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液在4 ℃冷藏保存。

1.3.2 樣品前處理 稱(chēng)取紅糖樣品約2.0 g，于50 mL具塞離心管中加入8 mL水，渦旋振蕩使其充分溶解，加入8 mL 乙腈，渦旋5 min，加入1 g無(wú)水硫酸鈉，迅速振搖，渦旋振蕩1 min，以4 500 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移5 mL乙腈于15 mL離心管中，用氮吹儀在45 ℃下濃縮近干。加入體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇—水溶液5 mL，渦旋混勻后通過(guò)HLB固相萃取小柱(經(jīng)3 mL甲醇和3 mL水預(yù)活化)，保持流速約為1 mL/min，然后用3 mL超純水淋洗小柱。待淋洗液流盡，減壓抽干3 min，用4 mL甲醇洗脫，收集洗脫液在45 ℃下氮吹至干，加入1 mL初始流動(dòng)相溶解殘留物，溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 超高效液相色譜條件 色譜柱采用ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為 2 mmol/L乙酸銨水溶液，洗脫梯度為：0.0～1.0 min，B相保持70%，2.0～4.0 min，B相 70%～5%，4.0～7.0 min，B相保持5%，7.0～7.1 min, B相5%～70%，7.1～10.0 min，B相70%。柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流速0.3 mL/min。

1.3.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，正負(fù)離子同時(shí)掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；電噴霧電壓5 500 V (ESI+)，4 500 V(ESI-)；離子源溫度300 ℃；氣簾氣壓力2.76×105Pa；碰撞氣壓力為中等(Medium)；霧化器壓力3.79×105Pa；輔助氣壓力3.44×105Pa；入口電壓10.0 V；碰撞室出口電壓10.0 V。表1為9種目標(biāo)化合物的定性、定量離子對(duì)及最優(yōu)參數(shù)。

表1 9種化合物的質(zhì)譜參數(shù)?

? * 定量離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別配制質(zhì)量濃度為200 μg/L的9種雌性激素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用針泵直接進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚采用負(fù)離子獲得母離子，孕酮、甲孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮采用正離子掃描模式，對(duì)母離子施加合適碰撞能量，使其產(chǎn)生子離子，選取豐度強(qiáng)且干擾少的2對(duì)子離子，并優(yōu)化對(duì)應(yīng)離子對(duì)的去簇電壓(DP)、碰撞能(CE)、碰撞室出口電壓(CXP)、碰撞室入口電壓(EP)。綜合所有離子對(duì)響應(yīng)信號(hào)優(yōu)化質(zhì)譜離子源溫度(TEM)、碰撞壓力(Collision gas, CAD)、氣簾氣壓力(Curtain gas, CUR)、霧化氣壓力(GS1)、去溶劑氣壓力(GS2)和離子源噴霧電壓(Ion spray voltage, IS)。優(yōu)化結(jié)果：TEM為300 ℃，CXP為10 V，EP為10 V，負(fù)離子模式IS為-4 500 V，正離子模式IS為5 500 V，CUR為2.76×105Pa，GS1為3.79×105Pa，GS2為3.44×105Pa，CAD為Medium。在最優(yōu)條件下，9種雌性激素的MRM圖如圖1所示。

2.2 色譜條件優(yōu)化

流動(dòng)相的組成對(duì)色譜峰形、分離度及靈敏度產(chǎn)生影響，LC-MS/MS分析中正離子模式通過(guò)添加甲酸，負(fù)離子通過(guò)添加氨水或易揮發(fā)緩沖鹽來(lái)提高離子化效率，通過(guò)改變流動(dòng)相洗脫梯度來(lái)分離化合物。由于9種激素中無(wú)同分異構(gòu)體，且離子對(duì)相互無(wú)干擾，本試驗(yàn)重點(diǎn)考察了水+乙腈、0.1%甲酸水溶液+乙腈、2 mmol/L乙酸銨+乙腈、水+甲醇、0.1%甲酸水+甲醇、2 mmol/L乙酸銨+甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，9種目標(biāo)化合物離子對(duì)的響應(yīng)強(qiáng)度及色譜峰形。結(jié)果表明使用2 mmol/L乙酸銨+乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，9種激素的響應(yīng)最高，峰形尖銳且對(duì)稱(chēng)。還考察了流速為0.2，0.3，0.4 mL/min時(shí)的色譜圖，發(fā)現(xiàn)0.4 mL/min 時(shí)峰形最尖銳，但系統(tǒng)壓力高，且靈敏度低于0.3 mL/min條件下的靈敏度，因此本試驗(yàn)采用0.3 mL/min 流速。

2.3 樣品前處理優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇 參考高裕峰[7]的方法，在空白紅糖中加標(biāo)后考察不同試劑對(duì)目標(biāo)激素的提取效果，試驗(yàn)結(jié)果與其相同，使用乙腈提取效果較好，但存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。參考曾三妹等[6]的方法，先用水溶解紅糖，再用不同體積的乙腈提取，己烯雌酚回收率高于140%，雌三醇回收率低于60%，其他物質(zhì)回收率較好，因此繼續(xù)優(yōu)化提取條件。比較了體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈—水溶液作為提取劑時(shí)，添加不同質(zhì)量鈉鹽后的提取效果。往提取溶液中分別加入0.1，1.0，5.0 g的Na2CO3、Na2SO4、NaCl，渦旋振蕩1 min、4 500 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定。結(jié)果表明使用1.0，5.0 g Na2SO4時(shí)回收率效果最好。

2.3.2 固相萃取條件的優(yōu)化 食糖的主要成分是蔗糖，含有較多色素[15]，這些色素會(huì)隨著目標(biāo)化合物一起被提取出來(lái)，可能會(huì)干擾色譜分析，污染色譜柱和離子源，簡(jiǎn)單有效的前處理顯得尤為重要，本試驗(yàn)采用SPE方法對(duì)紅糖進(jìn)行凈化。研究者[8,16]常采用HLB或C18固相萃取柱進(jìn)行凈化不同基質(zhì)中的雌激素。與C18反相萃取柱相比，HLB固相萃取柱具有更好的穩(wěn)定性和廣泛的pH實(shí)用性，且凈化過(guò)程中柱體干涸對(duì)其影響不大，操作性更好，因此本試驗(yàn)直接選用HLB進(jìn)行凈化。在考察其凈化效果前，先驗(yàn)證HLB固相萃取柱對(duì)9種激素柱回收率。在5 mL水中加入100 ng激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液溶液，充分混勻，分別取3根固相萃取柱，每根柱上樣量為1 mL，經(jīng)過(guò)上樣、淋洗、洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)獯蹈?，乙腈—水?fù)溶至1 mL，定量測(cè)定9種激素的含量，結(jié)果表明HLB柱對(duì)9種激素的回收率為98.8%～101.3%。在食糖中添加10 μg/kg的激素，采取1.3.2的方法進(jìn)行前處理及上機(jī)測(cè)定，9種激素的回收率為92.2%～113.2%。

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng) UPLC-MS/MS是獸藥殘留檢測(cè)常用的檢測(cè)方法，但缺點(diǎn)是可能存在基質(zhì)效應(yīng)，造成定量結(jié)果不準(zhǔn)確。本試驗(yàn)研究了紅糖中9種雌性激素的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明9種化合物的基質(zhì)效應(yīng)均為80%～120%，可忽略不計(jì)，因此本試驗(yàn)采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)行定量分析。

圖1 9種激素的MRM圖

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性與檢出限及定量限 配制一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3的儀器分析條件下進(jìn)行測(cè)定，以響應(yīng)為縱坐標(biāo)，化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制線性方程，得出9種物質(zhì)在一定線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均>0.99，以3倍信噪比確定目標(biāo)化合物的檢出限，10倍信噪比確定目標(biāo)物的定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.2 方法的回收率及精密度 按照定量限、2倍定量限、10倍定量限共3個(gè)質(zhì)量濃度水平對(duì)空白紅糖進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，按照本方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差。如表3所示，4種雌激素平均回收率為 92.2%～113.2%，5種孕激素平均回收率為93.5%～105.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%，該方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足分析要求。

表39種激素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

Table3Spikedrecoveriesandrelativestandarddeviations(RSDs)ofninehormones(n=6)

化合物名稱(chēng)添加量/(μg·kg-1)回收率/%RSD/%雌酮 3.098.34.56.097.83.230.099.74.2己烯雌酚 3.0113.25.86.0108.64.130.0103.22.6雌二醇 3.0101.55.16.099.44.530.098.06.0雌三醇 3.0101.55.16.099.44.530.092.26.0孕酮 0.6100.33.21.296.25.46.095.43.3甲孕酮 0.6105.11.91.2 102.33.46.0 99.35.6醋酸氯地孕酮0.698.22.51.293.56.56.0102.33.7醋酸甲地孕酮0.6105.66.81.2103.25.46.097.83.8醋酸甲羥孕酮0.6102.35.81.296.65.56.098.31.6

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

采用本試驗(yàn)所建立的方法對(duì)網(wǎng)售及市售38種紅糖樣品進(jìn)行檢測(cè)，9種激素均未檢出。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定紅糖中4種雌激素和5種孕激素，方法簡(jiǎn)便、快速，系統(tǒng)的方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果表明本方法靈敏度高、定量準(zhǔn)確、回收率良好、操作簡(jiǎn)便，能滿足日常紅糖中雌性激素的測(cè)定要求，但是該方法未覆蓋更多的性激素，今后應(yīng)在此研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步擴(kuò)寬檢測(cè)激素的種類(lèi)，完善激素殘留檢測(cè)體系，以期為食糖安全生產(chǎn)和健康風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)提供參考。