常規(guī)水解法和氧化水解法對飼料及飼料原料中含硫氨基酸測定結(jié)果的比較分析

賀習文，李 宏，高勤葉，汪軍明，王 佳，郭 爽

（1.陜西秦云農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測有限公司，陜西 渭南 714000；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料質(zhì)量監(jiān)督測試中心，西安 710016）

氨基酸是構(gòu)成動物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。氨基酸在動物體內(nèi)通過代謝，可以合成動物組織的蛋白質(zhì)，以及合成體內(nèi)必須的酸、抗體、激素等含氨物質(zhì)，除此之外，氨基酸還能轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓衔锖椭?，為動物提供必須的能量，所以氨基酸對動物的生長、繁殖和哺乳有著至關(guān)重要的作用[1]。

目前已知的氨基酸種類有200多種，飼料中比較常見的有天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等17種常規(guī)氨基酸，在這17種常規(guī)氨基酸中，蛋氨酸和胱氨酸屬于含硫氨基酸，含硫氨基酸對生長發(fā)育階段的畜禽有著顯著的影響，在日糧中添加適量的含硫氨基酸可以顯著提高生產(chǎn)性能，因此對飼料中含硫氨基酸含量的監(jiān)控顯得尤為重要[2-5]。含硫氨基酸的測定方法中，有GB/T 18246-2000“飼料中氨基酸的測定”中的常規(guī)水解法和GB/T 15399-1994“飼料中含硫氨基酸測定方法——離子交換色譜法”中的氧化水解法[6-7]。于淑新等利用高效液相色譜-柱前衍生化法測定飼料中的含硫氨基酸，農(nóng)晉琦等利用氣相色譜法測定結(jié)合態(tài)含硫氨基酸[8-9]。

常用測定飼料及飼料原料中的含硫氨基酸的方法為常規(guī)水解法和氧化水解法，但在實驗中發(fā)現(xiàn)這兩種方法往往會出現(xiàn)兩種不同的結(jié)果[10-12]。本試驗利用GB/T 15399中氧化水解法和GB/T 18246-2000中的常規(guī)水解法兩種方法來對飼料及飼料原料中的含硫氨基酸進行測定，旨在探討哪一種前處理方法對含硫氨基酸的測定結(jié)果最佳，為飼料和飼料原料中含硫氨基酸的測定方法的選擇提供參考。

1 試驗原理、材料及方法

1.1 試驗原理

1.1.1 常規(guī)水解法原理

常規(guī)水解法是使飼料蛋白在110℃、c（HCl）=6 mol·L-1鹽酸作用下，水解成單一氨基酸，再經(jīng)離子交換色譜法分離并以茚三酮做柱后衍生測定。

1.1.2 氧化水解法原理

飼料中的含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）用過甲酸氧化并經(jīng)鹽酸水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，此二物可用離子交換色譜法分離測定。

1.2 試驗材料

1.2.1 試劑及溶液

鹽酸（優(yōu)級純）；檸檬酸三鈉（分析純）；硫二甘醇（分析純）；苯酚（分析純）；過氧化氫（30%優(yōu)級純）；甲酸（88%分析純）；硝酸銀（分析純）；偏重亞硫酸鈉（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；一級水。

6 mol·L-1鹽酸溶液：量取500 mL鹽酸混入提前準備好的500 mL水中。

6.8 mol·L-1鹽酸溶液：量取567 mL鹽酸混入提前準備好的433 mL水中。

過甲酸溶液：將30%過氧化氫和88%甲酸按1∶9的體積比混合，在室溫中放置1 h，冰水浴中放置30 min，臨用前配制（濃縮料需按3 mg·mL-1加入硝酸銀）。

偏重亞硫酸鈉溶液：稱取33.6 g偏重亞硫酸鈉加水定容至100 mL，臨用前配制。

檸檬酸鈉緩沖液（pH=2.2）：稱取檸檬酸三鈉19.6 g，用水溶解后加入鹽酸16.5 mL，硫二甘醇5.0 mL，苯酚1 g，加水定容至1 000 mL。

100 nmol·L-1混合氨基酸標準工作液：含有磺基丙氨酸、蛋氨酸砜、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等20種氨基酸標準工作液。

1.2.2 儀器及設備

德國曼默博爾A300氨基酸分析儀（570 nm和440 nm雙波長）；恒溫干燥箱；十萬分之一天平；萬分之一天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；渦輪混合器。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗用樣品

雞用配合飼料、豬用濃縮飼料、魚粉、肉粉、豆粕、谷氨酸渣共6種不同基質(zhì)樣品，通過旋風磨粉碎，全部通過60目的樣品篩，混合均勻，保存在4℃的冰箱中冷藏。

1.3.2 前處理方法

樣品按照GB/T 18246-2000中常規(guī)水解法，稱取100 mg樣品于水解管中，加入6 mol·L-1鹽酸溶液10.0 mL，置液氮中冷凍后抽真空封口，放在恒溫干燥箱中110℃下水解24 h，冷卻，搖勻，過濾，吸取約0.3～0.5 mL試樣液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至干，加少許水重復蒸發(fā)至干，再加入3～5 mL檸檬酸鈉緩沖液（pH=2.2）溶解，渦輪混合，過0.22μm水相膜后上機測定。

樣品按照GB/T 15399-1994中氧化水解法，稱取50 mg樣品于水解管中，加入冷卻后的過甲酸溶液2 mL，放置在0℃冰水浴中反應16 h，取出后加入偏重亞硫酸鈉溶液0.5 mL，劇烈搖勻以終止反應，再加入6.8 mol·L-1鹽酸溶液17.5 mL，封口，放在恒溫干燥箱中110℃下水解24 h，冷卻，搖勻，過濾，吸取試樣液約0.3～0.5 mL于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至干，加少許水重復蒸發(fā)至干，再加入檸檬酸鈉緩沖液（pH=2.2）1～2 mL，溶解，渦輪混合，過0.22μm水相膜后上機測定。

2 試驗結(jié)果

2.1 色譜圖比較

按照2.3中的試驗方法，分別取配合飼料、濃縮飼料、魚粉、肉粉、豆粕、谷氨酸渣等不同的樣品，按照GB/T 18246常規(guī)水解法和GB/T 15399氧化水解法分別對含硫氨基酸進行定性、定量分析。為雞用配合飼料用兩種方法所做試驗的圖譜見圖1～2。

圖1 雞用配合飼料常規(guī)水解法圖譜

圖2 雞用配合飼料氧化水解法圖譜

由圖1和2可知，胱氨酸和蛋氨酸經(jīng)過過甲酸溶液氧化后，再經(jīng)過110℃的鹽酸溶液水解，已經(jīng)完全轉(zhuǎn)換為磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，通過對磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的計算，從而得到胱氨酸和蛋氨酸的實際含量。通過對不同樣品進行實驗，得到的實驗數(shù)據(jù)如表1所示。

使用常規(guī)水解法和氧化水解法分別測定飼料及飼料原料中含硫氨基酸時，氧化水解法檢測的胱氨酸和蛋氨酸的值明顯比常規(guī)水解法高，只有魚粉及肉粉等動物性原料的蛋氨酸差距很小，兩種方法的偏差都在允許誤差之內(nèi)。

2.2 精密度和穩(wěn)定性比較

表1中的魚粉1樣品為能力比對樣品，將魚粉1樣品用常規(guī)水解法和氧化水解法分別處理8組平行樣品，得到的蛋氨酸結(jié)果和相對標準偏差RSD如表2。

由表2可知，同時處理8組平行樣品，氧化水解法的RSD為1.7%，常規(guī)水解法的RSD為2.0%，氧化水解法明顯優(yōu)于常規(guī)水解法。

2.3 回收率比較

魚粉1樣品為有準確檢測數(shù)值的質(zhì)控樣品，其胱氨酸的實值為0.57，誤差為±0.06，蛋氨酸的實值為1.72，誤差為±0.24，用氧化水解法和常規(guī)水解法分別對魚粉1樣品中的胱氨酸和蛋氨酸進行檢測，得出的結(jié)果和回收率見表3。

由表3可知，兩種方法同時檢測魚粉中的含硫氨基酸，結(jié)果表明常規(guī)水解法檢測胱氨酸的回收率為61.4%，蛋氨酸的回收率為103.5%；氧化水解法檢測胱氨酸的回收率為96.4%，蛋氨酸的回收率為102.9%，氧化水解法明顯優(yōu)于常規(guī)水解法。

表1 不同樣品常規(guī)水解法和氧化水解法的實驗數(shù)據(jù) %

表2 兩種方法得到的蛋氨酸結(jié)果和相對標準偏差RSD

表3 兩種方法檢測含硫氨基酸的實測值和回收率 %

3 結(jié)果與討論

試驗結(jié)果表明，使用常規(guī)水解法和氧化水解法分別測定飼料及飼料原料中含硫氨基酸，氧化水解法檢測6種不同基質(zhì)樣品的胱氨酸和蛋氨酸值明顯高于常規(guī)水解法，其中魚粉及肉粉等動物性原料的蛋氨酸差距不大，兩種方法檢測的值都在允許誤差之內(nèi)。另外以質(zhì)控樣品作為參考，分別使用兩種方法測定其含硫氨基酸，結(jié)果表明，氧化水解法檢測的結(jié)果比常規(guī)水解法要更加準確，回收率更高，且穩(wěn)定性更好，更適用于飼料及飼料原料中含硫氨基酸的檢測。目前有很多測定飼料中含硫氨基酸含量的新方法，但對測定儀器和操作人員的要求較高[13-16]。因此，建議濃縮飼料、配合飼料、豆粕等植物性飼料采用氧化水解法測定含硫氨基酸，肉粉、魚粉、羽毛粉等動物性飼料及原料采用氧化水解法測定胱氨酸，采用常規(guī)水解法測定蛋氨酸。這樣能夠為實驗者提供方法選擇參考，同時因為常規(guī)水解法操作簡單，能夠節(jié)省時間和試劑材料，有良好的使用價值。