一株野生側(cè)耳菌種鑒定及生物學(xué)特性

孫瑞澤 張耀玲 王勝寶 劉勇 陳進(jìn) 黃重 魏玲 魏芳勤 荊丹 陳永剛 王艷龍 瞿艷麗 高紅玲 楊秀麗

摘? 要：以1株野生側(cè)耳屬菌株為試驗(yàn)材料，采用ITS測(cè)序、同源序列比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行鑒別，通過單因素試驗(yàn)確定影響其菌絲生長(zhǎng)的因素。結(jié)果表明：該野生側(cè)耳屬菌株為哥倫比亞側(cè)耳（Pleurotus columbinus），其菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為牛肉膏，最適碳氮比為10∶1，最適pH值為6.0，最適培養(yǎng)溫度為25～30℃。

關(guān)鍵詞：哥倫比亞側(cè)耳;ITS測(cè)序;生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S646.14? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? ?文章編號(hào) 1007-7731（2019）09-0034-4

Abstract：A wild Pleurotus strain was used as a test material. The wild strain was identified by ITS sequencing， homologous sequence alignment and phylogenetic tree construction. The biological characteristics were determined by single factor test.The results showed that the wild Pleurotus strain was identified as Pleurotus columbinus， the best carbon source was sucrose，the best nitrogen source was beef extract，the optimum carbon to nitrogen ratio was 10：1，the optimum pH value was 6.0， and the optimum culture temperature range was 25-30℃.

Key words：Pleurotus columbinus;ITS sequencing;Biological characteristics

側(cè)耳屬真菌營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，是我國(guó)栽培面積較大的食用菌種類[1-2]。側(cè)耳屬的傳統(tǒng)分類及鑒定主要是基于子實(shí)體的宏觀形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)特征的由于其子實(shí)體形態(tài)受到地域分布、子實(shí)體發(fā)生時(shí)間以及環(huán)境條件等因素的影響而出現(xiàn)不穩(wěn)定性，且一些近緣物種的子實(shí)體形態(tài)非常相似，僅僅依靠外形很難分辨，因而傳統(tǒng)的分類方法已無法滿足一些未知種屬真菌的分類及鑒定要求[3-4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多學(xué)者利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行菌物系統(tǒng)發(fā)育和菌種輔助鑒定，其中以ITS序列分析技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。rDNA的ITS序列具有高度保守性，表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，同時(shí)也有可以變化的區(qū)域，其有較為豐富的變異位點(diǎn)，這為種屬間的區(qū)分提供了可能[5]。本研究以采自秦巴山區(qū)的1株野生側(cè)耳菌株進(jìn)行ITS測(cè)序及同源序列比對(duì)，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定該菌株為哥倫比亞側(cè)耳（Pleurotus columbinus）;同時(shí)，對(duì)其生物學(xué)特性開展了研究，旨在明確該菌株的最適碳源、氮源、碳氮比、pH值、溫度等生理指標(biāo)，為其后續(xù)馴化栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試野生側(cè)耳菌株于2017年采自陜西省鎮(zhèn)巴縣小洋村，經(jīng)組織分離獲得原種備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野生側(cè)耳菌株的分子鑒定 采用DNA提取試劑盒提取DNA，利用通用引物ITS1、ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行ITS序列測(cè)序，測(cè)得序列登錄NCBI網(wǎng)站用Blast工具進(jìn)行同源序列比對(duì)，從GenBank下載搜索到排名前6位同源序列的ITS序列，應(yīng)用MEGA-X軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用kimura2-parameter模式計(jì)算遺傳距離，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap參數(shù)設(shè)定為1000。

1.2.2 影響菌絲生長(zhǎng)因素的確定

1.2.2.1 碳源 參照張國(guó)廣等[3]方法進(jìn)行，以葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，維生素B110mg，瓊脂20g）中20g葡萄糖的含碳量為標(biāo)準(zhǔn)，分別用與20g葡萄糖相等含碳量的玉米粉、麥芽糖、果糖、淀粉、蔗糖代替葡萄糖進(jìn)行碳源因子比較試驗(yàn)，觀察不同碳源處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.2.2 氮源 以葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，維生素B110mg，瓊脂20g）中5g蛋白胨的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)，分別用與5g蛋白胨相等含氮量的硝酸銨、硫酸銨、谷氨酸、酵母浸粉、牛肉膏、硝酸鉀、尿素代替蛋白胨進(jìn)行氮源因子比較試驗(yàn)，觀察不同氮源處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.2.3 碳氮比 在葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，改變蛋白胨添加量配成碳氮比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的培養(yǎng)基，觀察不同碳氮比處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.2.4 溫度 在葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，分別設(shè)置15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等5個(gè)培養(yǎng)溫度，觀察不同溫度處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.2.5 pH值 在葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，觀察不同pH值處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定 以上每個(gè)處理3次重復(fù)，接種后每日觀察菌絲生長(zhǎng)情況，直至其中1個(gè)處理中菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后停止觀察，測(cè)量菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率[3]。菌絲生長(zhǎng)速率（mm/d）=菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度/培養(yǎng)天數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用平均值±方差的方式表述。對(duì)各處理菌絲平均生長(zhǎng)速率進(jìn)行方差分析，用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較和顯著性分析（P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著）[3]。