高羊茅硅結(jié)合蛋白的初步提取及鑒定

新布任 王濤 馬燕妮 宋涵 王明明

摘? 要：選取禾本科植物高羊茅的葉片，采用低溫?fù)v碎分級(jí)分離方法，分離出天然硅體，進(jìn)一步分離硅體和硅質(zhì)化細(xì)胞壁，去除硅質(zhì)化細(xì)胞壁組分中的雜質(zhì)蛋白，并利用硅體的專(zhuān)一性染色法進(jìn)行驗(yàn)證后，再進(jìn)一步提取出粗的硅結(jié)合蛋白，通過(guò)SDS-PAGE鑒定出大小為117kDa的硅結(jié)合蛋白，最終通過(guò)切膠回收透析的方法獲取純凈的硅結(jié)合蛋白，得出了一套有效的硅體分離提取的方法。該研究首次從高羊茅葉片中分離提取硅體，為高羊茅的抗逆性研究及快速生長(zhǎng)研究提供了蛋白獲取基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：硅結(jié)合蛋白;高羊茅;低溫?fù)v碎分級(jí)分離法;SDS-PAGE

中圖分類(lèi)號(hào) S143? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? ?文章編號(hào) 1007-7731（2019）09-0011-3

硅在自然界中分布廣泛，巖石、水流及動(dòng)植物體內(nèi)等均有其存在，主要以二氧化硅和硅酸鹽等形式存在，陸地生物系統(tǒng)和海洋生物系統(tǒng)大部分都存在硅的生物循環(huán)[1]。研究表明，硅是在植物生長(zhǎng)的過(guò)程中，即使過(guò)量也不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生危害作用的有益元素。如今硅肥已經(jīng)是世界各地普遍使用的無(wú)任何毒副作用的新型肥料，是具有增產(chǎn)和抗逆的作用的天然農(nóng)藥[2]，硅的主動(dòng)吸收機(jī)制在很多植物內(nèi)都存在[3]，參與生物體很多的新陳代謝過(guò)程，其在動(dòng)物以及單細(xì)胞生物（如硅藻）中的必需性已有研究證明[4]。硅對(duì)于植物生長(zhǎng)有益，硅元素的缺乏會(huì)導(dǎo)致非典型環(huán)境脅迫[5]。

硅以硅結(jié)合蛋白的形式存在于植物體，史新慧等研究表明，禾本科植物中含有大量的硅結(jié)合蛋白，并分離出水稻SBP117硅結(jié)合蛋白[6]。硅結(jié)合蛋白可以提高植物的光合作用和根系活性，增強(qiáng)植物的抗倒伏性、抗病能力、抗逆能力[7-9]，降低植物的蒸騰作用，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，促進(jìn)養(yǎng)分的吸收。細(xì)胞壁、硅化細(xì)胞和胞間隙或角質(zhì)層是硅在植物體內(nèi)的主要沉積位置[10]。Yoshida等[11]研究表明，在水稻葉片中，硅元素含量最高的部位是葉尖，硅元素主要的沉積部位為葉片的上下表皮、維管束鞘以及相連的厚壁細(xì)胞。

高羊茅（Festuycaelata）屬禾本科、羊茅屬多年生草本植物，因其耐熱，耐踐踏，草坪成型快，顏色濃綠，抗逆性強(qiáng)，管理方便以及成本低等優(yōu)點(diǎn)，一直是足球場(chǎng)、高爾夫場(chǎng)、公園等的綠化優(yōu)選草種。劉慧霞等[12]研究表明，在高鹽環(huán)境下，硅能提高高羊茅的適應(yīng)能力[13]。宋銳研究表明，在高鹽的脅迫下，硅通過(guò)直接參與高羊茅的生理生化過(guò)程，提高了其在高鹽環(huán)境下幼苗的適應(yīng)能力[14]。本研究利用低溫?fù)v碎提取法對(duì)在高鹽環(huán)境中生存的高羊茅進(jìn)行了硅結(jié)合蛋白的提取并鑒定，為高羊茅的抗逆性及快速生長(zhǎng)研究提供蛋白獲取基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大小適中、均勻一致的高羊茅種子。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子發(fā)芽試驗(yàn) 將購(gòu)買(mǎi)的高羊茅種子裝入紙袋放置暗處室溫下貯藏。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇成熟、飽滿、大小適中且一致的種子，先進(jìn)行消毒，用蒸餾水反復(fù)沖洗，將種子表面水分用濾紙吸干后，整齊地放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿放50粒種子，選擇不同濃度外源硅離子（硅酸鉀+氯化鉀）來(lái)培育。外源硅離子的濃度分別為：2mmol/L的硅酸鉀溶液（K2SiO3）和4mmol/L的氯化鉀溶液（KCl）的Si+組，以及加入4mmol/L的硅酸鉀溶液（K2SiO3）和8mmol/L的氯化鉀溶液（KCl）的Si++組。當(dāng)K2SiO3溶于水后，加入的Cl-后會(huì)阻止弱酸根離子生成H2SiO3，使得實(shí)驗(yàn)所需Si2+誤差變小。KCL中的K+是植物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)元素，文獻(xiàn)報(bào)道低濃度的Cl-個(gè)對(duì)植物基本上沒(méi)有影響。每組進(jìn)行3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)組，放在光照培養(yǎng)箱內(nèi)（20℃，16/8h，15000l）培養(yǎng)，至種子萌發(fā)長(zhǎng)出四葉后備用。

1.2.2 天然硅體的分離 采用低溫?fù)v碎分級(jí)分離法從發(fā)芽好的高羊茅中分離天然硅體，具體步驟如下：

1.2.2.1 分離出硅體和硅質(zhì)化細(xì)胞壁 取高羊茅葉片剪碎，放于-20℃冰箱，冷凍過(guò)夜后取出放于室溫，融化后與1%TrionX-100按照體積比1∶3進(jìn)行混合，之后用JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī)搗碎、1mm篩網(wǎng)過(guò)濾，得到濾液。靜置，自然沉降3min直至沉降物不再增多，棄掉上清。用0.1%SDS溶液重懸沉降物，靜置棄上清，反復(fù)至上清液透明為止，去除大部分非硅質(zhì)化細(xì)胞壁碎片及細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，獲得粗制硅體及硅質(zhì)化細(xì)胞壁。

1.2.2.2 去除硅質(zhì)化細(xì)胞壁組分中的雜質(zhì)蛋白 將以上得到淺綠色沉降物，參照史新慧[15]的方法，將沉降物與2%SDS漂洗液按照體積比1∶4進(jìn)行混合，放于90℃1h，期間間歇式混勻后水洗，重復(fù)以上操作。最后將上清棄掉，保留沉降物，再用丙酮進(jìn)行漂洗，將沉降物與丙酮按照體積比1∶2進(jìn)行混合在室溫下攪拌直至無(wú)黃色物質(zhì)析出。最后用高鹽溶液漂洗，將沉降物與6mol/LNaCl按照體積比1∶4進(jìn)行混合，室溫下攪拌30min后，棄上清并水洗，留沉降物。

1.2.2.3 獲得純粹的硅體 將以上得到的沉降物用40um的篩網(wǎng)過(guò)濾，除去大的硅質(zhì)化細(xì)胞壁碎片，獲得純粹的硅體。

1.2.3 硅體的專(zhuān)一性染色法 參照Dyanaakan等[16]的染色方法，依次進(jìn)行脫色、酸處理、脫水、染色，最后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察硅體形態(tài)。

1.2.4 提取硅結(jié)合蛋白 參照Harrison[17]的方法，先用NH4F進(jìn)行處理，按每1g濕硅質(zhì)化細(xì)胞壁加入4mL 10mol/LNH4F在數(shù)顯恒溫磁力攪拌器攪拌，直至在顯微鏡觀察硅體溶解完全，再用HF處理將收集的細(xì)胞壁與8%HF溶液同體積混合，攪拌3h，收集濾液，將濾液進(jìn)行透析，使用冷凍干燥處理濃縮，收集干燥物即為硅結(jié)合蛋白。

1.2.5 通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定硅結(jié)合蛋白的大小 參照Hermannn和Gebhard[18]的方法進(jìn)行跑電泳，跑完電泳后將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染色液中緩慢搖動(dòng)30～60min進(jìn)行染色處理，最后將凝膠浸泡于洗脫液中緩慢搖動(dòng)1～2h，其間更換洗脫液1～2次，洗脫后凝膠照像。

1.2.6 純化硅結(jié)合蛋白 根據(jù)Mashairo S等[19]的方法，用透析袋電洗脫法洗脫純化目的蛋白，將所需目的條帶從SDS-PAGE凝膠切下，放入透析袋后進(jìn)行電泳回收，將透析袋放進(jìn)盛有預(yù)冷的Tris甘氨酸電泳緩沖液直至考馬斯亮藍(lán)完全從凝膠條帶上跑出，再進(jìn)行4℃透析，最后用冷丙酮沉淀法處理透析袋內(nèi)的液體進(jìn)行蛋白沉淀。采用Brandford法，測(cè)定純化的蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硅離子濃度對(duì)高羊茅種子發(fā)芽生長(zhǎng)的影響 本次研究表明，Si+組比Si++組高羊茅葉片長(zhǎng)勢(shì)不同，Si+組高羊茅葉片豐富，生長(zhǎng)密度高，平均長(zhǎng)度為7～8cm，同一周期內(nèi)生長(zhǎng)比較快，而Si++組高羊茅葉片比較稀疏，生長(zhǎng)密度較Si+組低，平均長(zhǎng)度為6～7cm，同一周期內(nèi)生長(zhǎng)比較緩慢。

2.2 不同硅離子濃度對(duì)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響 如圖1所示，a箭頭所指為在光學(xué)顯微鏡下油鏡（10×100倍鏡）觀察到Si+組的硅細(xì)胞，硅細(xì)胞形態(tài)短而粗，在葉表皮細(xì)胞之間的夾縫產(chǎn)生，不同視野硅細(xì)胞數(shù)量較少。b箭頭所指為在光學(xué)顯微鏡下油鏡（10×100倍鏡）觀察到Si++組的硅細(xì)胞，硅細(xì)胞形態(tài)長(zhǎng)而細(xì)，在葉表皮細(xì)胞之間的夾縫產(chǎn)生，不同視野硅細(xì)胞數(shù)量較多。

2.3 硅結(jié)合蛋白分子的大小 由圖2可知：泳道1：Marker：泳道2～4：從加入了2mmol/L硅酸鉀溶液（K2SiO3）和4mmol/L氯化鉀溶液（KCl）的Si+組發(fā)芽的高羊茅提取的硅結(jié)合蛋白，泳道5～7：從加入了4mmol/L硅酸鉀溶液（K2SiO3）和8mmol/L氯化鉀溶液（KCl）的Si++組發(fā)芽的高羊茅提取的硅結(jié)合蛋白。通過(guò)SDS-PAGE鑒定，硅結(jié)合蛋白的大小為117kDa。

3 討論

提取的硅體在顯微鏡下觀察，Si++組較Si+組的的硅細(xì)胞形態(tài)長(zhǎng)而細(xì)，不同視野硅細(xì)胞數(shù)量較多，且從SDS-PAGE電泳的結(jié)果圖來(lái)看，Si++組的高羊茅提取的硅結(jié)合蛋白含量較高，并鑒定出了硅結(jié)合蛋白的大小。硅促進(jìn)植物生長(zhǎng)主要通過(guò)3種方式，即影響葉片光合作用、減少倒伏和增強(qiáng)根系活性等。在維管組織和表皮細(xì)胞中硅的沉積增強(qiáng)組織的機(jī)械性能，從而增大了葉片受光面積、提升了群體光合效率。硅細(xì)胞長(zhǎng)而細(xì)的形態(tài)可能更有利于植物進(jìn)行光合作用，增強(qiáng)抗逆性。在植物體內(nèi)硅元素主要存在于細(xì)胞壁、硅化細(xì)胞和胞間隙或角質(zhì)層。在高羊茅草的葉鞘中，硅體主要存在于硅化細(xì)胞、泡狀細(xì)胞、硅質(zhì)化表皮細(xì)胞以及硅質(zhì)化表皮毛等。大部分硅質(zhì)化表皮細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)形。

植物體中，硅的存在形態(tài)為水化無(wú)定形二氧化硅（SiO2·nH20）、二氧化硅（SiO2）、硅酸和膠狀硅酸，其中水化無(wú)定形二氧化硅（SiO2·nH20）、二氧化硅（SiO2）為主要存在形態(tài)[21]。不同植物對(duì)硅的吸收能力不同，與植物本身的基因型和環(huán)境有關(guān)，在pH小于9的條件下，硅以單硅酸Si（OH）4的形式被植物吸收。目前認(rèn)為高等植物由于硅與不同植物種類(lèi)的關(guān)系不同，硅的吸收形式有主動(dòng)吸收、被動(dòng)吸收和拒絕吸收3種[22]。硅對(duì)于高羊茅的抗逆性及生長(zhǎng)促進(jìn)作用機(jī)制有待今后作進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]劉鳴達(dá)，張玉龍，陳溫福.土壤供硅能力評(píng)價(jià)方法研究的歷史回顧與展望[J].土壤，2006（1）：11-16.

[2]MaJ.F.，Y.Miyake，E.Takahashi.Silicon as a beneficial element for crop plants.In：Datonoff L.，G Korndoref，G.Synder，eds.Silicon in Agriculutre[J].New York：Elsevier Science，2001：17-39.

[3]TamaiK.，J.F.Ma.CharaeteriZation of silicon uptake by rice roots[J].New Phytol.，2003，158：431-436

[4]wernerD.，R.Roth.Silica metabolism[J].In：Inorganic Plnat Nutrition.New York：New Series，1983.

[5]EPsteinE.The anomaly silicon in Plant biology[J].Proc，Natl.Acad.Sci.USA，1994，91：11-17.

[6]史新慧，覃闖登，宋建蘭.水稻及其他禾本科植物體內(nèi)硅結(jié)合蛋白的免疫印跡檢測(cè)[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005，32（4）：371-376.

[7]EPsteinE.Silicon.Annu.Rev.Plant Physiol[J].Plant Mol. Biol.，1999，

50：641-664.

[8]NeumnanD.，U.Zurnieden.Silicon and heavy metal tolernace of higher Plnats[J].Phytochemistry，2001，56：685-692.

[9]Linag.YC.，J.W.C.Wong，L.Wei.Silicon-mediated enhancement of cadmium tolerance in maize（ZeamyasL.）grown in cadmium contmainated soil[J].Chemosphere，2005，58（4）：475-484.

[10]李文彬.水稻體內(nèi)硅的生理功能及沉積機(jī)理的研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[11]Yoshida S.，Y.Ohnishi，K.Kigatishi.Histochmseltry of silicon in rice Plant.II.Localization of silicon within rice tissues[J].Soil Sci.Plant Nutr.，1962，8（l）：36-41.