Pou6f2基因對泌乳素腺瘤MMQ細胞增殖和分泌能力的影響

苗亞洲，謝微嫣，李儲忠，張亞卓

(首都醫(yī)科大學 北京市神經外科研究所，北京100070)

泌乳素腺瘤是最常見的功能性垂體腺瘤，占垂體腺瘤的32%～66%[1]。臨床上多數(shù)泌乳素腺瘤被認為是良性腫瘤，經多巴胺受體激動劑和手術治療均能取得較好的效果。但是，有一部分泌乳素腺瘤具有耐藥性和侵襲性生長的特點，目前尚無有效的治療方法[2,3]。隨著高通量測序技術的發(fā)展，探究泌乳素腺瘤發(fā)生發(fā)展過程中基因水平上的變化成為可能，為我們發(fā)現(xiàn)新的分子治療靶點提供了新方法。在前期研究中，我們通過對泌乳素腺瘤組織的高通量測序，發(fā)現(xiàn)了Pou class6同源框2(Pou6f2)的雙等位基因突變，提示Pou6f2可能在泌乳素腺瘤的發(fā)生發(fā)展中起十分重要的作用。以往研究表明，Pou6f2在腎母細胞癌中扮演腫瘤抑制因子的角色[4]。目前，尚未有Pou6f2在泌乳素腺瘤中的研究報道。2018年6～11月，我們主要通過向泌乳素腺瘤MMQ細胞中轉染特異性小干擾RNA(siRNA)干擾Pou6f2表達，或轉染高表達質粒過表達Pou6f2，從而探究Pou6f2對MMQ細胞增殖和分泌泌乳素(PRL)能力的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠MMQ細胞和F12K培養(yǎng)基購自ATCC公司(美國)，馬血清和胎牛血清購自Gibco公司(美國)；鼠源Pou6f2-siRNA、含無義序列的陰性對照control-siRNA購自GenePharma公司(中國)，Pou6f2過表達質粒、空載質粒購自GenScript公司(美國)；Lipofectamine?3000轉染試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司(美國)，非變性蛋白裂解液購自普利萊基因技術有限公司(中國)；Pou6f2抗體購自Origene公司(美國)，β-actin抗體購自冠星宇科技公司(中國)；MTS購自Promega公司(美國)，ELISA試劑盒購自BioVision公司(美國)。

1.2 MMQ細胞復蘇與培養(yǎng) 將凍存的MMQ細胞從液氮中取出后，37 ℃水浴鍋中迅速解凍；在離心機中以1 500 r/min離心5 min，超凈工作臺中棄去凍存管中上清；用含雙抗、2.5%胎牛血清、15%馬血清的F12K培養(yǎng)基重懸后種入培養(yǎng)瓶中,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24 h后對新復蘇的細胞傳代，臺盼藍染色測定細胞活力>99%，改為不含雙抗的完全培養(yǎng)基，48 h后鋪板轉染。

1.3 MMQ細胞分組與轉染

1.3.1 敲低Pou6f2實驗 將MMQ細胞鋪6孔板，8×105/孔，鋪3個孔，分為對照組和實驗1、2組。鋪板24 h后，細胞處于對數(shù)生長期，根據(jù)Lipofectamine?3000轉染試劑盒說明書，對照組和實驗1、2組分別轉染control-siRNA、Pou6f2-siRNA-1、Pou6f2-siRNA-2。72 h后收集細胞，提取細胞蛋白質。轉染所用各siRNA見表1。

表1 轉染所用各siRNA序列

1.3.2 過表達Pou6f2實驗 將MMQ細胞鋪6孔板，8×105/孔，鋪2個孔，分為對照組和實驗組。對照組轉染空載質粒，實驗組轉染野生型Pou6f2質粒。鋪板24 h后，細胞處于對數(shù)生長期，此時根據(jù)Lipofectamine?3000轉染試劑盒說明書轉染質粒。72 h后收集細胞，提取細胞蛋白質。

1.4 MMQ細胞中Pou6f2蛋白檢測 采用Western blotting法。收集各組轉染72 h后的MMQ細胞，將細胞轉移至1.5 mL的EP管中，PBS洗1遍，再次離心后吸干上層的PBS；向各個EP管中加入含蛋白酶抑制劑的非變性蛋白裂解液50 μL，渦旋后冰上裂解30 min；以12 000 r/min離心15 min，吸取上層蛋白液40 μL，BCA法測定蛋白濃度；然后向蛋白液中加入10 μL 5×上樣緩沖液，渦旋后沸水煮5 min,冰上放置5 min。根據(jù)BCA法所測得的各蛋白濃度，統(tǒng)一上樣蛋白量；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后5%TBS-T牛奶封閉1 h；孵育Pou6f2抗體，1∶2 000稀釋比例，4 ℃過夜；TBS-T洗膜10 min×3次后，再孵育相應的兔抗1 h；再次洗膜后，用化學發(fā)光法發(fā)光，得到相應的條帶圖像。β-actin為一步發(fā)光法，1∶4 000稀釋比例室溫孵育1 h，TBS-T洗膜10 min×3次后直接化學發(fā)光法發(fā)光，得到相應條帶。以β-actin為內參，以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度比值表示Pou6f2的相對表達量。

1.5 MMQ細胞增殖活性測定 采用MTS法。將生長狀態(tài)良好的MMQ計數(shù)后，用完全培養(yǎng)基調整細胞密度至5×104/mL。將細胞轉移至96孔板中，每孔100 μL；24 h后細胞處于對數(shù)生長期，按照Lipofectamine?3000轉染試劑盒說明書進行轉染。分組與轉染方法同1.3，每組設置5個平行復孔。細胞置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL的MTS，然后繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標儀測量96孔板各孔在波長490 nm處的吸光度值(A490)，以此表示細胞的增殖活性。

1.6 細胞分泌PRL水平測定 采用ELISA法。取各組轉染72 h的MMQ細胞，離心后保留細胞上清，并同時對各組的細胞進行計數(shù)。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀讀取各組在450 nm波長處的OD值；按照說明書要求以OD值為縱坐標，不同濃度標準品為橫坐標，繪制標準曲線。根據(jù)此標準曲線和各組細胞上清測得的OD值求出各組細胞上清中PRL水平。為排除細胞數(shù)量不同對各組細胞上清PRL水平的影響，我們用細胞數(shù)對所得PRL進行校準。我們定義一個指標A，A=細胞上清的PRL值/細胞數(shù)，作為衡量MMQ細胞分泌PRL能力的指標[5]。最后將對照組的值歸一化為1，算出各實驗組的相對PRL水平。

2 結果

2.1 敲低Pou6f2表達對MMQ細胞增殖活性、分泌功能的影響

2.1.1 各組MMQ細胞Pou6f2表達比較 實驗1、2組MMQ細胞Pou6f2相對表達量分別為0.812±0.016、0.766±0.055，均低于對照組的1.067±0.076(P均<0.01)，實驗1、2組間差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 敲低Pou6f2實驗中各組MMQ細胞Pou6f2表達情況(Western blotting法)

2.1.2 各組MMQ細胞增殖活性比較 實驗1、2組MMQ細胞的相對增殖活性分別為1.020±0.085、0.912±0.020，均高于對照組的0.605±0.055(P均<0.01)，實驗1、2組間差異無統(tǒng)計學意義。

2.1.3 各組MMQ細胞分泌PRL水平比較 實驗1、2組MMQ細胞分泌PRL的相對水平分別為1.280±0.105、1.273±0.035，均高于對照組的1.000±0.043(P均<0.01)，實驗1、2組間差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 過表達Pou6f2對MMQ細胞增殖活性、分泌功能的影響

2.2.1 兩組MMQ細胞Pou6f2表達比較 實驗組MMQ細胞Pou6f2相對表達量為1.990±0.057，高于對照組的1.177±0.096(P<0.01)。見圖2。

圖2 過表達Pou6f2實驗中各組MMQ細胞Pou6f2表達情況(Western blotting法)

2.2.2 兩組MMQ細胞增殖活性比較 實驗組MMQ細胞的相對增殖活性為0.815±0.048，低于對照組的1.083±0.052(P<0.01)。

2.2.3 兩組MMQ細胞分泌PRL水平比較 實驗組MMQ細胞分泌PRL的相對水平為0.911±0.025，低于對照組的1.00±0.028(P<0.01)。

3 討論

泌乳素腺瘤是一種單克隆起源的腫瘤，這就意味著自發(fā)性的體細胞突變在泌乳素腺瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[6]。隨著測序技術的發(fā)展，Valimaki等[7]在散發(fā)性促生長激素腺瘤中發(fā)現(xiàn)了鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基突變，Reincke、Ma等[8,9]在促腎上腺皮質激素腺瘤中發(fā)現(xiàn)了特異性泛素化蛋白酶8的突變。雖然，Bi和Song等[10,11]也對泌乳素腺瘤進行高通量測序，但尚未有特異性的基因突變被發(fā)現(xiàn)。在前期研究中，我們通過對泌乳素腺瘤組織及其配對血液的高通量測序，發(fā)現(xiàn)有1例患者的腫瘤組織中具有Pou6f2的雙等位基因突變，提示Pou6f2可能在泌乳素腺瘤中起重要作用。

Pou6f2是Pou家族的成員之一，Pou蛋白家族是一組可以通過結合特定的DNA序列以指導特定基因表達的轉錄因子，其主要調控胚胎發(fā)育、參與細胞類型的特異性分化過程。Pou結構域由N端的Pou特異性結構域和C端的Pou同源結構域組成，這些結構域由可變長度的不太保守的接頭區(qū)域連接在一起。在哺乳動物中，基于Pou結構域的氨基酸序列以及接頭區(qū)域保守的程度將Pou分成了6類(Pou1f～Pou6f)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Pou蛋白家族涉及各種組織的發(fā)育和分化過程，且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。例如：Pou1f1主要在垂體中表達，在垂體的發(fā)育過程中，Pou1f1主要通過激活生長激素和泌乳素基因來引導原始垂體細胞分化為生長激素細胞和泌乳素細胞，該基因的突變將導致垂體激素的合成缺乏[13]；Pou3f2的過表達可導致黑素瘤細胞過度增殖[12]；Pou3f4在內耳發(fā)育中發(fā)揮作用，被認為參與誘導紋狀體神經元的分化，該基因的突變與X染色體相關的非綜合征性混合性耳聾有關[14,15]；Pou5f1編碼的蛋白OCT4以劑量敏感的方式賦予小鼠胚胎干細胞致瘤性，使高表達OCT4的腫瘤表現(xiàn)出更高的惡性程度[16,17]。目前，Pou6f2的研究主要集中在眼角膜和腎臟的發(fā)育方面。King等[18]研究表明，Pou6f2在人類角膜內皮細胞的分化過程中起著非常重要的作用，是潛在的青光眼危險因子。Di Renzo等[19]發(fā)現(xiàn)，Pou6f2在未分化的后腎間質和小鼠胚胎腎的原始腎源性結構中含量較高，推測Pou6f2可能在腎臟發(fā)育過程中具有特定的作用。值得注意是，Perotti等[4]在腎母細胞腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)了Pou6f2兩個種系的雜合突變，提示Pou6f2可能作為一種腫瘤抑制因子參與了腎母細胞瘤的遺傳易感性。此外，Kang等[20]發(fā)現(xiàn)，Pou6f2是低級別唾液腺黏液表皮樣癌第二常見的突變基因。

在本研究中，我們通過降低和增加MMQ細胞中Pou6f2的表達量，觀察Pou6f2對MMQ細胞增殖和分泌PRL能力的影響。其中，MMQ細胞是大鼠泌乳素腺瘤細胞系，而Pou6f2是鼠源Pou6f2的名稱。我們發(fā)現(xiàn)，當過表達Pou6f2時，MMQ細胞增殖能力降低，分泌PRL能力減弱；而當干擾Pou6f2的表達時，MMQ細胞增殖能力提高，分泌PRL能力增強。與在腎母細胞瘤中相似，本研究結果表明Pou6f2在泌乳素腺瘤中也是作為腫瘤抑制因子存在，提示Pou6f2突變在泌乳素腺瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起著非常重要的作用。但是，Pou6f2在泌乳素腺瘤中發(fā)揮作用的具體機制還不清楚。還有一些研究發(fā)現(xiàn)，Pou6f2在大鼠的垂體干細胞中表達，并且Pou6f2在胚胎早期含量較為豐富，隨著垂體的發(fā)育其含量逐漸下降[21]，提示Pou6f2可能參與垂體的發(fā)育過程。我們認為，Pou6f2的突變可能引起了垂體發(fā)育過程中的一些變化，從而導致泌乳素腺瘤的發(fā)生，這將有待我們后續(xù)的研究去證明?？傊?，Pou6f2可以抑制MMQ細胞增殖，降低其分泌PRL的能力，有望成為泌乳素腺瘤治療的新分子靶點。