奧美沙坦酯對糖尿病腎病大鼠腎臟保護(hù)作用及對腎組織Nephrin、VEGF表達(dá)的影響

朱曉娜，王玉環(huán)，吳娟娟，董鵬，張敏

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，西安710004；2西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致殘率、致死率不斷上升的主要原因。微量白蛋白尿或蛋白尿是DN最早出現(xiàn)的臨床癥狀，其發(fā)生機(jī)制目前尚不清楚。越來越多的證據(jù)表明，腎小球足細(xì)胞損傷與DN進(jìn)展性蛋白尿的產(chǎn)生密切相關(guān)。研究表明，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可影響足細(xì)胞Neohrin的表達(dá)，誘導(dǎo)足細(xì)胞足突融合。腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活與DN的進(jìn)展關(guān)系密切，其中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在DN的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[1,2]，早期使用 AngⅡ受體抑制劑(ARBs)可預(yù)防和改善DN患者蛋白尿的出現(xiàn)。2011年新英格蘭雜志發(fā)表的ROADMAP研究顯示，奧美沙坦酯可延緩或者預(yù)防2型糖尿病患者微量白蛋白尿的發(fā)生[3]；DN動物實驗研究顯示，早期使用ARBs對DN蛋白尿的改善作用可能與其對足細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)[4,5]。2014年1月～2015年12月，我們觀察了奧美沙坦酯干預(yù)對DN大鼠腎臟的保護(hù)作用，并通過觀察腎組織足細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Nephrin和VEGF的表達(dá)變化，探討其保護(hù)腎臟功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物準(zhǔn)備 健康雄性8周齡SD大鼠共30只，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(許可證號SCXK陜2007-001)，清潔級，體質(zhì)量180～220 g。每籠5只，飼養(yǎng)于SPF標(biāo)準(zhǔn)實驗室，溫度(23±2)℃、濕度55%±5%，每日12 h光照維持晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食飲水，每日更換墊料、飼料及飲水。所有動物實驗得到西安交通大學(xué)實驗動物管理委員會許可，動物實驗過程符合《西安交通大學(xué)動物實驗管理指南》。

1.2 動物分組與造模 將大鼠普通標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為NC組10只和實驗組20只。實驗組腹腔注射1% 鏈脲佐菌素(STZ) 65 mg/kg(Sigma公司，避光溶解于0.1 mmol/L pH 4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)，NC組腹腔注射同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后禁食尾靜脈取血，空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L為造模成功；注射STZ 4周后，代謝籠內(nèi)收集24 h尿液檢測尿蛋白，并尾靜脈取血檢測FBG、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。造模過程中實驗組大鼠FBG不達(dá)標(biāo)2只，DN造模成功18只。

1.3 藥物干預(yù) 將實驗組DN造模成功的18只大鼠隨機(jī)分為兩組各9只，DN組予以0.5%羥甲基纖維素鈉灌胃，OM組予以奧美沙坦酯(Melone公司)10 mg/kg溶解于0.5%羥甲基纖維素鈉灌胃；從第4周起開始干預(yù)，共干預(yù)8周。

1.4 腎臟功能指標(biāo)檢測 干預(yù)8周后，代謝籠內(nèi)收集24 h尿液檢測尿蛋白，禁食不禁水后尾靜脈取血檢測Scr、BUN。

1.5 腎組織病理觀察 腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉大鼠，暴露腹腔，用DEPC水處理過的手術(shù)器械取出左右腎臟，冰盒上清除腎臟表面包膜及周圍游離結(jié)締組織。將左腎沿橫截面切開后置于4%甲醛溶液中固定保存，右腎放入凍存管并置于液氮中保存。取大鼠左腎組織進(jìn)行石蠟包埋切片，進(jìn)行HE和PAS染色，觀察腎組織病理變化。

1.6 腎組織VEGF、Nephrin mRNA檢測 采用RT-PCR法。取大鼠右側(cè)腎皮質(zhì)，用TRIzol法提取總RNA；進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得產(chǎn)物以實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)行實時定量熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s, 40個循環(huán)，56 ℃(GAPDH，Nephrin)/58 ℃(VEGF)40 s退火。引物由上海捷瑞生物公司設(shè)計合成：GADPH上游引物5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′、下游引物5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，VEGF上游引物5′-TTCGTCCAACTTCTGGGCTCTT-3′、下游引物5′-CTCCTCTTCCTTCTCTTTCTCCC-3′，Nephrin上游引物5′-TGTGTACCTGGGGTCTTGGA-3′、下游引物5′-AGGACTGGTTCGTCTTGTCG-3′。以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.7 腎組織VEGF、Nephrin蛋白檢測 采用Western blotting法。取大鼠右側(cè)腎皮質(zhì)50 mg，加入蛋白裂解液RIPA研磨后冰上靜置30 min；4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，上清液即為蛋白產(chǎn)物。采用BCA法測定蛋白濃度后，以1∶4的比例加入5×Reducing Sample Buffer；混勻后離心，100 ℃加熱3 min變性。采用10% SDS-PAGE凝膠恒壓120 V電泳90 min，使用PVDF膜在恒流200 mA并且冰袋降溫的條件下轉(zhuǎn)膜2.5 h。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜4次后一抗稀釋(1∶2 000，Proteintech公司)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜4次后二抗稀釋(1∶5 000，Santa公司)37 ℃孵育2 h。TBST洗膜4次后，膜上滴加ECL發(fā)光液；置于化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)曝光5 min，記錄存儲圖片，以目的條帶與內(nèi)參β-actin灰度比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組腎臟功能指標(biāo)比較 見表1。

表1 各組24 h尿蛋白、Scr、BUN比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05。

2.2 各組腎組織病理情況 NC組腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰可見，球囊壁光滑，毛細(xì)血管及系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)分布正常，基底膜未見增厚；DN組腎臟組織可見不同程度的基底膜增厚、系膜基質(zhì)的增加，部分腎臟組織還可見腎小球內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張、腎小球硬化、腎小囊裂隙樣改變以及腎小管上皮細(xì)胞的顆粒樣變性和空泡樣改變；OM組腎小球基底膜增厚及系膜基質(zhì)增加的程度較DN組減輕。

2.3 各組腎組織Nephrin、VEGF mRNA及蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 各組腎組織中Nephrin、VEGF mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05。

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活與DN的進(jìn)展關(guān)系密切。腎素主要由腎臟產(chǎn)生，進(jìn)入血液循環(huán)后可將血管緊張素原水解為AngⅠ，AngⅠ可在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACEI)作用下水解為AngⅡ，AngⅡ主要是通過激動血管緊張素受體AT1發(fā)揮作用。AngⅡ在DN蛋白尿的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[1,2]。通過對糖尿病患者及動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，ARBs類藥物可降低蛋白尿，對腎臟有一定保護(hù)作用[6,7]。奧美沙坦酯是一種新型ARBs，與傳統(tǒng)ARBs相比其突出的特點是高度選擇性。它可以與AT1的2個位點結(jié)合，一個是-OH，另一個是-COOH，而其他ARBs只與AT1的-OH結(jié)合。因此，奧美沙坦酯的作用更加持久穩(wěn)定。2011年新英格蘭雜志發(fā)表的ROADMAP研究發(fā)現(xiàn)，通過對4 447例2型糖尿病患者隨機(jī)、雙盲、多中心臨床對照試驗，發(fā)現(xiàn)奧美沙坦酯治療組及安慰劑治療組蛋白尿發(fā)生率分別為8.2%和9.8%，奧美沙坦組發(fā)生微量白蛋白尿時間延長23%,顯示奧美沙坦酯可延緩或預(yù)防2型糖尿病患者微量白蛋白尿的發(fā)生[3]。在糖尿病動物實驗中也同樣發(fā)現(xiàn)，奧美沙坦酯可明顯降低糖尿病大鼠尿蛋白，改善腎臟功能[8]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，給予奧美沙坦酯灌胃治療后，DN組尿蛋白減少，Scr、BUN降低。這些與上述文獻(xiàn)報道結(jié)果一致，提示奧美沙坦酯有一定的腎臟保護(hù)作用。

目前，人們普遍認(rèn)為腎小球足細(xì)胞損傷在DN的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。足細(xì)胞損傷受各種理化因素影響，足細(xì)胞裂孔隔膜上表達(dá)的各種蛋白分子均可作為其損傷的標(biāo)志物。Nephrin是調(diào)節(jié)足細(xì)胞裂孔隔膜結(jié)構(gòu)和功能的重要蛋白，可影響腎小球濾過膜的通透性及蛋白尿的產(chǎn)生。在對包括DN在內(nèi)的一些腎臟蛋白尿疾病患者及動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，腎小球Nephrin mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平下降，且在腎小球足細(xì)胞足突融合和消失及蛋白尿出現(xiàn)之前就出現(xiàn)明顯下降。體外足細(xì)胞實驗還發(fā)現(xiàn)，在魚精蛋白誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷足突融合過程中，Nephrin蛋白的磷酸化較正常足細(xì)胞增多。自從將Nephrin蛋白的磷酸化及脫磷酸化與足細(xì)胞損傷及蛋白尿聯(lián)系起來后發(fā)現(xiàn)，Nephrin蛋白在生理學(xué)上對足細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)及功能有著重要作用。這些可說明Nephrin在腎臟蛋白尿疾病的病理學(xué)進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，被作為腎臟蛋白尿疾病早期足細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志物之一。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，DN組腎組織Nephrin mRNA及蛋白表達(dá)較NC組減少，OM組用奧美沙坦酯干預(yù)后腎組織Nephrin mRNA及蛋白表達(dá)增加。這提示DN大鼠出現(xiàn)了足細(xì)胞損傷，而奧美沙坦酯對DN足細(xì)胞損傷有一定修復(fù)作用。

在以往的研究報道中，Jia等[9]給予SD大鼠AngⅡ喂養(yǎng)14 d后可出現(xiàn)高血壓和蛋白尿，足細(xì)胞裂孔隔膜變窄以及Nephrin mRNA和蛋白表達(dá)增加，喂養(yǎng)28 d后可明顯發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞凋亡及Nephrin mRNA和蛋白表達(dá)減少，并且足細(xì)胞凋亡數(shù)與Nephrin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。有學(xué)者進(jìn)一步進(jìn)行動物實驗和細(xì)胞實驗后發(fā)現(xiàn)，AngⅡ?qū)е翹ephrin脫磷酸化及足細(xì)胞凋亡與Caveolin-1磷酸化相關(guān)，并且推測Ang Ⅱ-Caveolin-1-Nephrin信號通路可為腎素-血管緊張素系統(tǒng)相關(guān)足細(xì)胞損傷疾病的治療提供新靶點[10]。動物實驗研究顯示，奧美沙坦酯對DN蛋白尿的改善作用可能與其對足細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)[4,5]。這些研究結(jié)果均提示，AngⅡ的增多可能導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。本實驗中OM組給予ARBs奧美沙坦酯干預(yù)后，DN大鼠足細(xì)胞損傷改善，尿蛋白排泄、Scr、BUN降低。我們推測，奧美沙坦酯的腎臟保護(hù)作用與其阻斷AngⅡ信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致Nephrin表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

通過對牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可促進(jìn)VEGF的釋放。Kang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在足細(xì)胞中加入AngⅡ后，VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)增加與AngⅡ存在劑量依賴性關(guān)系，在給予氯沙坦后AngⅡ誘導(dǎo)的VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)增加被抑制。動物實驗顯示，DN大鼠腎臟組織中VEGF表達(dá)明顯升高、尿蛋白增多，給予AngⅡ受體阻滯劑L158809干預(yù)后大鼠VEGF表達(dá)下調(diào)、尿蛋白減少。本實驗中，DN大鼠VEGF mRNA和蛋白表達(dá)增多，給予奧美沙坦酯干預(yù)后VEGF mRNA和蛋白表達(dá)減少，與上述文獻(xiàn)報道一致。

VEGF與DN足細(xì)胞損傷、蛋白尿出現(xiàn)關(guān)系密切。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-A的基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變及DN有關(guān)[12,13]。人體腎臟組織活檢發(fā)現(xiàn)，在DN早期VEGF mRNA表達(dá)增多[14]；同樣，在嚙齒類DN動物模型中也發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)增多[15]。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，VEGF亞型VEGF165可誘導(dǎo)足細(xì)胞Nephrin及VEGFR2酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致足細(xì)胞足突融合[16]。有學(xué)者在阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎臟蛋白尿疾病模型中發(fā)現(xiàn)，VEGF表達(dá)較正常大鼠明顯升高，同時Nephrin表達(dá)下降。上述研究均提示VEGF與足細(xì)胞損傷關(guān)系密切，可調(diào)控Nephrin的表達(dá)。本實驗中奧美沙坦酯干預(yù)后DN大鼠VEGF表達(dá)減少，Nephrin表達(dá)上調(diào)，尿蛋白排泄減少。由此我們推測，奧美沙坦酯可阻斷AngⅡ信號傳導(dǎo)，進(jìn)而下調(diào)VEGF表達(dá)、上調(diào)Nephrin表達(dá)，從而減少大鼠尿蛋白的排泄，對腎臟有一定保護(hù)作用。