鳥苷酸交換因子C3G過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2凋亡的影響及機(jī)制

張旭，陳旺盛，張夢嬌，蔣文捷，梁雪梅

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

目前全球有超過3億的糖尿病患者，而糖尿病引起的心臟改變是其發(fā)生心力衰竭和導(dǎo)致死亡的主要原因。持續(xù)的高血糖水平可使心肌細(xì)胞發(fā)生廣泛變性、壞死與凋亡，最終導(dǎo)致心肌功能障礙、心臟功能衰竭[1]。多項研究提示，心肌細(xì)胞凋亡與糖尿病心肌病(DCM)的發(fā)生發(fā)展有直接關(guān)系，而目前與DCM中心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)的分子機(jī)制仍不清楚[2]。因此，深入探討DCM的凋亡機(jī)制并找到調(diào)控的靶點，對于DCM的干預(yù)具有深遠(yuǎn)的理論與臨床意義。鳥苷酸交換因子C3G是結(jié)合在接頭蛋白(Crk)SH3結(jié)構(gòu)域中的主要蛋白，在人體組織中廣泛表達(dá)[3]。研究提示，C3G高表達(dá)于大鼠的腦、心臟、肝臟和肌肉等組織中，主要參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡等重要生物學(xué)行為，尤其在心肌細(xì)胞及神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育中起重要作用[4]。多項研究結(jié)果顯示，與凋亡有關(guān)的蛋白或多或少都與C3G有關(guān)，而這些凋亡蛋白同樣作用于心肌細(xì)胞[5]。所以，我們有理由認(rèn)為C3G在心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。2015年7月～2018年1月，我們觀察了過表達(dá)C3G對高糖環(huán)境中心肌細(xì)胞凋亡的影響，以及C3G上游信號分子CrkL、下游信號分子磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)表達(dá)變化，以期為DCM的發(fā)病及其防治尋找新的理論依據(jù)，并從信號分子途徑為C3G作為DCM的臨床干預(yù)靶點提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 陰性慢病毒和C3G過表達(dá)慢病毒均由上海吉凱公司構(gòu)建合成，大鼠H9C2胚胎心肌細(xì)胞購自中科院上海生命科學(xué)研究院，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、D-葡萄糖均購自美國Gibco公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體(sc-47778)、兔抗大鼠C3G抗體(sc-15359)購自Santa Cruz公司，小鼠抗大鼠CrkL抗體(3182)、兔抗大鼠p-ERK1/2抗體(4370)購自Cell Signaling公司；流式細(xì)胞技術(shù)所用試劑(Annexin V-FITC、PI)購自江蘇碧云天生物研究所。

1.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒感染 將對數(shù)生長期的心肌細(xì)胞分別接種于6個直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，在含10% FBS、低糖(5 mmol/L)的DMEM普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%左右后換液分為兩份，分別用空白試劑(低糖培養(yǎng)基)、陰性病毒、過表達(dá)C3G慢病毒感染。培養(yǎng)24 h后，重新消化細(xì)胞并計數(shù)。

1.3 心肌細(xì)胞高糖干預(yù)模型建立 分別取上述感染后的細(xì)胞，接種于6個平板中(Western blotting用培養(yǎng)皿，流式細(xì)胞計數(shù)用6孔板)，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h讓其充分貼壁；將其中一份培養(yǎng)基置換為含10% FBS、5.5 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基，標(biāo)記為空白組、陰性病毒組、過表達(dá)C3G組；另一份培養(yǎng)基置換為含10%FBS、33.3 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基，標(biāo)記為空白+高糖組、陰性病毒+高糖組、過表達(dá)C3G+高糖組；各組均繼續(xù)培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下顯示細(xì)胞的病毒感染率均>90%以上停止培養(yǎng)。

1.4 心肌細(xì)胞凋亡率測算 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組細(xì)胞，將其懸浮后按凋亡檢測試劑盒說明書步驟依次加入Annexin V-FITC、PI后行流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 心肌細(xì)胞C3G、p-ERK1/2和CrkL蛋白檢測 采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；BCA法檢測蛋白濃度，用10% SDS-聚丙烯酰胺分離凝膠。各組分別上樣30 μg蛋白，電泳分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上；4%牛奶37 ℃封閉2 h后，分別加一抗孵育12 h以上，洗膜；孵育二抗，再洗膜；然后通過 ECL發(fā)光試劑盒顯影成像，進(jìn)行吸光度值定量分析。實驗重復(fù)3次，采用Quantity-One軟件分析各組蛋白的相對表達(dá)量。用C3G與內(nèi)參β-actin吸光度比值表示C3G蛋白相對表達(dá)量，同法計算p-ERK1/2和CrkL蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較 與空白組(3.241%±0.869%)、陰性病毒組(3.428%±1.086%)比較，過表達(dá)C3G組細(xì)胞凋亡率(1.493%±0.626%)降低，而空白+高糖組(10.776%±2.284%)、陰性病毒+高糖組(10.934%±2.368%)細(xì)胞凋亡率增加(P均<0.05)；與空白+高糖組、陰性病毒+高糖組比較，過表達(dá)C3G+高糖組(5.633%±1.629%)細(xì)胞凋亡率降低(P均<0.05)。

2.2 各組心肌細(xì)胞C3G、p-ERK1/2和CrkL表達(dá)比較 與空白組、陰性病毒組比較，過表達(dá)C3G組C3G、p-ERK1/2蛋白表達(dá)均增加(P均<0.05)而CrkL蛋白表達(dá)無差異，空白+高糖組、陰性病毒+高糖組C3G、p-ERK1/2和CrkL蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)；與空白+高糖組、陰性病毒+高糖組比較，過表達(dá)C3G+高糖組C3G、p-ERK1/2蛋白表達(dá)均增加(P均<0.05)，而CrkL蛋白表達(dá)無差異。見圖1、表1。

注：A為空白組,B為陰性病毒組,C為過表達(dá)C3G組,D為空白+高糖組,E為陰性病毒+高糖組,F為過表達(dá)C3G+高糖組。

圖1各組心肌細(xì)胞C3G、p-ERK1/2、CrkL蛋白表達(dá)(Western blotting法)

表1 各組心肌細(xì)胞C3G、p-ERK1/2和CrkL蛋白相對表達(dá)量比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性病毒組比較，bP<0.05；與過表達(dá)C3G組比較，cP<0.05；與空白+高糖組比較，dP<0.05；與陰性病毒+高糖組比較，eP<0.05。

3 討論

DCM是發(fā)生在獨立于冠心病或高血壓引起的心肌損害以外的糖尿病心肌改變，從第一次概念的提出，至今已有40多年，然而其發(fā)生的確切機(jī)制目前仍不完全清楚[6]。從國內(nèi)外的研究結(jié)果顯示，糖尿病的慢性高血糖會導(dǎo)致心肌氧化應(yīng)激、代謝紊亂，心肌細(xì)胞肥大、凋亡、纖維化和收縮功能障礙,最終導(dǎo)致DCM[7,8]。目前，心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是研究的熱點，而對于DCM的凋亡機(jī)制目前仍無確切的結(jié)果。

作為細(xì)胞主要表面受體的整合素家族，參與了心肌細(xì)胞的生長發(fā)育、增殖、分化、凋亡等多個生理過程。例如：整合素家族的β1、β3亞基及其下游的多個信號分子都具有抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌細(xì)胞生長，對梗死后心臟重塑、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展具有重要的保護(hù)作用[9,10]。C3G作為整合素信號通路成員之一，可能參與梗死后心臟重構(gòu)、缺血性心肌病和心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[11,12]。研究提示，C3G基因缺失會引起果蠅幼體心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的畸形和功能障礙，導(dǎo)致幼體死亡[13]；因此，我們推測C3G可能通過改善2型糖尿病的氧化損傷、凋亡等途徑來預(yù)防心血管并發(fā)癥[14]。CrkL作為C3G上游信號分子，過表達(dá)可以抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[15]。ERK是一種絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，可能存在于整合素信號通路的下游，介導(dǎo)細(xì)胞多種生物化學(xué)反應(yīng)。p-ERK1/2能夠調(diào)控細(xì)胞的凋亡、增殖等過程，并且對心肌細(xì)胞有明顯保護(hù)作用[16,17]。

在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，C3G在大鼠心肌細(xì)胞中存在表達(dá)，過表達(dá)C3G質(zhì)?？稍黾哟笫笮募〖?xì)胞中C3G蛋白表達(dá)；并且，C3G過表達(dá)質(zhì)粒具有降低心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其增殖生長的能力；C3G過表達(dá)質(zhì)粒還能顯著降低大鼠心肌細(xì)胞因缺氧/復(fù)氧損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡，增加其增殖能力[11,18]。本研究結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境下，心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死、凋亡，C3G、p-ERK1/2、CrkL蛋白表達(dá)均下降，細(xì)胞凋亡率增加；經(jīng)過感染過表達(dá)C3G慢病毒后，可以增加高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞C3G蛋白表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死。由此，我們可以得出，過表達(dá)C3G可以抑制高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞凋亡，具有保護(hù)高糖環(huán)境中心肌細(xì)胞的作用。當(dāng)心肌細(xì)胞受到持續(xù)高糖損傷時，我們也觀察到p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著增加；而作為C3G上游信號分子CrkL，其在過表達(dá)C3G組卻沒有差異。由此，我們進(jìn)一步可以推測，過表達(dá)C3G抑制高糖環(huán)境中心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死的機(jī)制與促進(jìn)p-ERK1/2蛋白表達(dá)有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們可以進(jìn)一步研究探討心肌細(xì)胞中是否存在C3G-ERK1/2信號通路或者C3G與其他有關(guān)抑制心肌細(xì)胞凋亡的信號分子。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，持續(xù)高糖環(huán)境能引起心肌細(xì)胞凋亡增加；過表達(dá)C3G可以降低高糖環(huán)境中心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞，其機(jī)制可能與促進(jìn)p-ERK1/2蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究為過表達(dá)C3G抑制糖尿病引起的心肌細(xì)胞凋亡提供了可能的理論依據(jù)，隨著研究的深入，會有越來越多的研究進(jìn)一步證實C3G在DCM中的心肌保護(hù)作用，也將進(jìn)一步明確其互相作用的信號通路，C3G有望成為探索DCM發(fā)病機(jī)制的新靶點。