不同稀釋液成分對(duì)綿羊精子低溫保存效果的影響

施會(huì)彬，王玉琴,2*，何翁潭，吳至博，田志龍，張 才,2，趙戰(zhàn)勤,2

（1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng)471023；2.河南省肉羊繁育工程技術(shù)研究中心，河南洛陽(yáng)471003）

在動(dòng)物生殖系統(tǒng)中，副性腺的分泌物有很重要的作用：分泌物在射精之前先排出以沖洗尿生殖道從而避免危害精子[1]；副性腺的分泌物為偏堿性，剛排出精子是弱酸性，處于“體眠”狀態(tài)，精子的弱酸性在陰道中被分泌物中和后，精子會(huì)解除休眠狀態(tài)，活力增加[2]；分泌物是精子天然的緩沖液，可以抵抗陰道中的酸性物質(zhì)，使精子在陰道內(nèi)部運(yùn)輸、貯存時(shí)維持較好的活性與受精能力[3]?；谶@一發(fā)現(xiàn)，為改善精液保存效果，減少精液浪費(fèi)，精液稀釋液引起越來(lái)越多的關(guān)注。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于綿羊精液液態(tài)保存的相關(guān)報(bào)道有很多。趙曉娥等[4]、岳奎忠等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊精液稀釋液中添加葡萄糖、EDTA、檸檬酸鈉、卵黃等物質(zhì)對(duì)精液保存有著良好的效果。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)現(xiàn)有的綿羊精液稀釋液配方進(jìn)行改進(jìn)，額外添加抗生素、脫脂牛奶和混合維生素，設(shè)計(jì)含有不同組分和含量外源物質(zhì)的6 個(gè)稀釋液配方，旨在篩選出更為經(jīng)濟(jì)有效、操作簡(jiǎn)單、可普遍應(yīng)用的稀釋液配方。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇飼養(yǎng)在河南省洛寧縣國(guó)家肉羊洛陽(yáng)試驗(yàn)站、外形體況及其他品種習(xí)性行為活動(dòng)尤其是性行為活動(dòng)（包括趴跨、射精、互動(dòng)積極等）均正常的成年澳洲白綿羊4 只。采精前1 周內(nèi)每只公羊開(kāi)始補(bǔ)飼雞蛋3 枚/d，胡蘿卜適量。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材及藥品 實(shí)驗(yàn)器材包括假陰道、保溫瓶，試管、熱水器、全自動(dòng)邁朗精子分析儀（購(gòu)自南寧松景天倫生物科技有限公司），恒溫水浴鍋等。

藥品：葡萄糖粉由金維他（福建）食品有限公司生產(chǎn)，脫脂牛奶為湖北黃岡伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，雙蒸水，檸檬酸鈉為河南千至商貿(mào)有限公司生產(chǎn)，維生素ADE 注射液（維生素A：50 IU/μL；維生素D：25 IU/μL；維生素E：0.04 mg/μL）購(gòu)自哈爾濱中精生物科技有限公司，新鮮雞蛋，青霉素由四川億豐生物制劑有限公司生產(chǎn)，鏈霉素由華北制藥集團(tuán)動(dòng)物保健品有限責(zé)任公司生產(chǎn)，恩諾沙星注射液（0.025 mg/μL）由山西省芮城科龍獸藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 配方設(shè)計(jì) 各稀釋液配方中，除含有相同量的葡萄糖組分，其他物質(zhì)不盡相同。與配方四稀釋液相比，配方三稀釋液中除不含雙抗外，稀釋液中其他組分與配方四相同。不同稀釋液配方見(jiàn)表1。

1.4 精液采集及分析 選擇1 只體重約50 kg、體格健壯的發(fā)情母羊作為臺(tái)羊，采用常規(guī)假陰道法采集種公羊精液，選用精液云霧運(yùn)動(dòng)好、乳白色、無(wú)異味、畸形率5%以下、死亡率在0.10 以下、活力在0.85 以上的精液，稀釋液溫度為36～39℃時(shí)，分別在已清洗消毒干燥好的試管內(nèi)按照稀釋比1∶4 稀釋。隨后立刻進(jìn)行相應(yīng)檢查，分別取活力在0.8 以上的0.8 mL 精液倒入6 個(gè)10 mL離心管中，分裝到每組對(duì)應(yīng)的密封管中，做好標(biāo)號(hào)，用紗布包起24 個(gè)樣（每組稀釋液4 個(gè)重復(fù)），放入已準(zhǔn)備好的保溫箱內(nèi)，4℃保存。每間隔6 h 進(jìn)行1 次檢測(cè)，持續(xù)檢測(cè)96 h。利用全自動(dòng)精子分析儀檢測(cè)精子畸形率、活力（檢測(cè)采用百分制表示）、速度（精子在稀釋液中直線游動(dòng)速度）和死亡率。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，制作Excel 表格，使用 SPSS 21.0 軟件法進(jìn)行單因素方差分析和Duncan's法進(jìn)行多重比較。分析結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配方精子畸形率隨時(shí)間變化結(jié)果 由表2 可知，配方四稀釋液稀釋后精子畸形率在18 h 之后均極顯著低于其他試驗(yàn)組（P＜0.01）；配方一組在48 h 后始終極顯著高于配方二組和配方三組（P＜0.01）；配方二組在18 h 與96 h 的精子畸形率極顯著高于配方三組（P＜0.01）；配方五組在54、60、96 h 的精子畸形率極顯著高于配方六組（P＜0.01）。

表1 不同稀釋液配方組成成分

表2 不同配方精子畸形率隨時(shí)間變化結(jié)果 %

2.2 不同配方精子死亡率隨時(shí)間變化結(jié)果 由表3 可知，配方三與配方四稀釋液稀釋精液12 h 后的精子死亡率均低于其他試驗(yàn)組（P＜0.01），其中配方三組精子死亡率極顯著高于配方四組（P＜0.01）；配方一組與配方二組的精子死亡率前54 h 差異不顯著（P＞0.05），配方一組84 h 精子全部死亡，配方二組96 h 精子全部死亡；配方六組精子死亡率6 h 后持續(xù)高于配方五組（P＜0.01），2 個(gè)配方組90 h 精子全部死亡。

2.3 不同配方精子活力隨時(shí)間變化結(jié)果 由表4 可知，配方三與配方四稀釋液稀釋精液6 h 后的精子活力極顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.01），其中配方四極顯著高于配方三（P＜0.01）；配方二、五、六試驗(yàn)組的精子活力在前60 h 差異不顯著（P＞0.05），60 h 以后配方二試驗(yàn)組的精子活力極顯著低于配方五和六（P＜0.01），84 h 配方二精子活力降為0，90 h 配方五和六精子活力降為0。

2.4 不同配方精子運(yùn)動(dòng)速率隨時(shí)間變化結(jié)果 由表5 可知，配方三稀釋精液6 h 后的精子運(yùn)動(dòng)速率極顯著低于配方四（P＜0.01）；配方五稀釋6 h 后的精子運(yùn)動(dòng)速率低于配方六（P＜0.01），2 組90 h 的精子速率降為0；配方一組與配方二組精子速率在6、12、30、36、78 h時(shí)差異不顯著（P＞0.05），配方二組其余測(cè)定時(shí)間的精子運(yùn)動(dòng)速率高于配方一組（P＜0.01），配方一組84 h的精子運(yùn)動(dòng)速率降為0，配方一、二組90 h 的精子運(yùn)動(dòng)速率降為0。

表3 不同配方精子死亡率隨時(shí)間變化結(jié)果 %

表4 不同配方精子活力隨時(shí)間變化結(jié)果 %

2.5 不同配方稀釋液精液品質(zhì)的比較 由圖1 可知，不同配方稀釋液精子畸形率隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增長(zhǎng)，其中配方一的增長(zhǎng)速度較其他試驗(yàn)組快，配方四的增長(zhǎng)速度緩慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)精子畸形率最低（圖1-a）。配方六稀釋液精子死亡率上升速度高于其他試驗(yàn)組，配方四精子死亡率上升速度最慢，且在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)精子死亡率小于1（圖1-b）。配方一稀釋液精子活力隨時(shí)間增長(zhǎng)下降速度最快，精子活力最先降為0，配方四稀釋液精子活力下降緩慢，且實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)精子活力大于0（圖1-c）。配方五稀釋液精子運(yùn)動(dòng)速率隨時(shí)間變化下降最快，運(yùn)動(dòng)速率最先降為0，配方四稀釋液精子運(yùn)動(dòng)速率下降緩慢，且實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)運(yùn)動(dòng)速率大于0（圖1-d）。稀釋后綿羊精液和精子形態(tài)見(jiàn)圖2。

3 討 論

新鮮精液射精量、活力、畸形率是精液品質(zhì)檢測(cè)的重要內(nèi)容，這些指標(biāo)反映精子質(zhì)量和精子的生存能力。綿羊的精液化學(xué)組成主要包括蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、脂質(zhì)、酶、維生素、有機(jī)酸和無(wú)機(jī)離子。精液稀釋后不僅可以擴(kuò)大容積，還可以為精子代謝提供所需的能量物質(zhì)[6-7]。稀釋液中含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化劑、酶和激素等各種成分可提高精子活率、延長(zhǎng)精子壽命。

脫脂牛奶在稀釋液中是一種重要的營(yíng)養(yǎng)劑。有研究表明，10%的脫脂牛奶用于綿羊精液稀釋?zhuān)?℃保存2 d后精子的活力和頂體完整率處于較高水平[8-9]。楊萍等[10]在精液的液態(tài)保存研究發(fā)現(xiàn)，1 月齡的山羊奶離心后可用于山羊精液的保存，與常規(guī)稀釋液相比不會(huì)顯著降低精子活力。本實(shí)驗(yàn)中稀釋液配方三、四和六中含有10%的脫脂牛奶，72 h 時(shí)配方三和四的精子死亡率和精子畸形率最低。國(guó)外有報(bào)道稱(chēng)，由于卵黃與存在于尿道球腺的蛋黃凝固酶發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，含有卵黃的山羊精液稀釋液會(huì)對(duì)精子造成損害，不利于精子存活，且在精子死亡后產(chǎn)生的氨化酶類(lèi)等物質(zhì)又能與卵黃繼續(xù)作用形成過(guò)氧化物等有害物質(zhì)，從而加速了精子死亡[11-12]。茆達(dá)干等[13]研究發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加卵黃后縮短了波爾山羊的精液保存時(shí)間，認(rèn)為卵黃對(duì)山羊精子有一定的副作用。也有學(xué)者認(rèn)為，一般精液稀釋液中的卵黃含量在15%～20%，可對(duì)精子起到保護(hù)作用[14]。郝永蘭等[15]在研究國(guó)外的Optidyl（含卵黃）和OPTIXcell（無(wú)卵黃）2 種稀釋液時(shí)發(fā)現(xiàn)，黑頭杜泊羊適合用無(wú)卵黃的OPTIXcell、白頭杜泊羊適合用有卵黃的Optidyl 進(jìn)行精液的稀釋及冷凍保存。因此，本實(shí)驗(yàn)中配方六與配方三、四都加入了脫脂奶粉，但配方六加入高濃度的卵黃可能是導(dǎo)致其精子死亡率和畸形率升高的直接原因。

表5 不同配方精子運(yùn)動(dòng)速率隨時(shí)間變化結(jié)果 μm/s

圖1 不同配方稀釋液精液品質(zhì)比較

圖2 綿羊精液（左）與精子形態(tài)（右）圖（10×40）

最初，精液稀釋液中常用的緩沖保護(hù)劑有檸檬酸鈉和磷酸二氫鈉，隨后人們發(fā)現(xiàn)Tris 及EDTA 等對(duì)于維持精液的滲透壓和pH 有較為理想的效果[16-18]。但因檸檬酸鈉不僅能有效控制pH 及滲透壓變化，而且成本低易操作[19]，因此較為常用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至72 h 時(shí)，配方四和六組中精子活力和精子運(yùn)動(dòng)速率高于配方二和五組，這可能與配方四和六稀釋液中含有較高濃度的檸檬酸鈉有關(guān)。

在采精過(guò)程中，由于外部環(huán)境和采精操作的影響，使得新鮮精液易受到細(xì)菌及微生物的污染。為了保證精液質(zhì)量并延長(zhǎng)精液保存時(shí)間，常在稀釋液中添加一定量的抗生素。有研究表明 ，精子的運(yùn)動(dòng)性能隨著抗生素濃度的增高呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)[20-21]。精子的運(yùn)動(dòng)性能與抗生素濃度存在密切關(guān)系[22]，因此精液稀釋時(shí)應(yīng)控制抗生素用量，避免損傷精子?，F(xiàn)階段精液稀釋液中常添加的抗生素類(lèi)藥物有青霉素、鏈霉素和慶大霉素等。茆達(dá)干等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在波爾山羊精液稀釋液中加入恩諾沙星較青、鏈霉素有更好的精液保存效果。與本實(shí)驗(yàn)72 h 時(shí)得到的結(jié)果相似，即加有恩諾沙星的配方三和五組的精子活力高于只含有青霉素和鏈霉素不含恩諾沙星的配方一和二組。

維生素不僅有較強(qiáng)的抗氧化性而且能有效去除溶液中的氧化物，被廣泛應(yīng)用于精液保存中，以提高精子的受精率和存活率[24-25]。Kumar 等[26]研究表明，維生素E 可有效增強(qiáng)水牛鮮精、解凍精液中精子的抗氧化性。這一研究結(jié)果與陳曉英等[27]相似。趙凱[28]研究發(fā)現(xiàn)，在水牛精液冷凍保存稀釋液中添加10-4mol/L 維生素D的效果較好。許多研究者還在不斷探索維生素在精液中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)不僅維生素D 和E 可以有效保護(hù)精子免受冷打擊，維生素A、維生素C 也有此效果[29]。本實(shí)驗(yàn)稀釋液配方二、三和四不僅添加了維生素E，還加入了維生素A 和維生素D，結(jié)果表明配方二、三、四稀釋液稀釋72 h 時(shí)的精子畸形率及死亡率均低于其他實(shí)驗(yàn)組，但精子運(yùn)動(dòng)速率高于其他實(shí)驗(yàn)組。新加入的維生素A 和維生素D 可能與維生素E 發(fā)揮著同樣的作用。

本實(shí)驗(yàn)最優(yōu)稀釋液配方四稀釋36 h 時(shí)精子活率為0.78，而韓天龍等[30]實(shí)驗(yàn)中配方B 稀釋液的精子活率在30 h 就已下降至0.78，對(duì)比2 組稀釋液配方發(fā)現(xiàn)，配方四比配方B 除了多加入抗生素、脫脂牛奶和混合維生素外，檸檬酸鈉用量也有所差異，這可能是導(dǎo)致2 組稀釋液配方對(duì)精子活率產(chǎn)生不同效果的直接原因。當(dāng)然，這也不排除澳洲白綿羊與杜泊羊之間的個(gè)體差異因素的影響。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，每100 mL 雙蒸水中添加3 g 葡萄糖粉、10 mL 脫脂牛奶、3 g 檸檬酸鈉、25 μL 維生素ADE 注射液、10 mL 卵黃、10 萬(wàn)IU 青霉素、5 萬(wàn)IU 鏈霉素和25 μL 恩諾沙星注射液，該配方稀釋后的精液48 h 后精子活率最高，可在綿羊人工授精生產(chǎn)中推廣使用。