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    FZD5 在山羊妊娠早期的表達(dá)及激素調(diào)控

    2019-06-18 01:20:02邢園園崔云鳳
    中國畜牧雜志 2019年6期
    關(guān)鍵詞:子宮腔孕酮發(fā)情

    邢園園,張 云,崔云鳳,任 杰,倪 華

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

    胚胎著床是妊娠建立的關(guān)鍵環(huán)節(jié),是影響繁殖效率的重要因素之一。尤其是體外操作的胚胎,著床率明顯低于體內(nèi)正常發(fā)育的胚胎[1],是胚胎工程技術(shù)的瓶頸之一。山羊是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,關(guān)于山羊胚胎著床的機(jī)制研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。已有研究表明,Wnt-FZD(Wingless/Int1-Frizzled)信號(hào)通路在多種動(dòng)物的胚胎著床過程中具有重要功能,如調(diào)控子宮內(nèi)膜層重建、子宮接受態(tài)的建立和胚胎黏附等過程[2]。FZD 蛋白家族共分為10 類(FZD1-10),結(jié)構(gòu)均為7 次跨膜受體。當(dāng)Wnt 配體與FZD 受體結(jié)合,可以啟動(dòng)經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、黏附和運(yùn)動(dòng)等功能[3]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)FZD5 參與多種癌癥的發(fā)生,F(xiàn)ZD5 基因沉默后可減少前列腺癌細(xì)胞PC3的遷移和增殖[4]。Peterson等[5]研究表明,F(xiàn)ZD5 受體與SFRP2(Secreted frizzled-related protein 2)結(jié)合激活Wnt/Ca2+通路,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放,激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFATC3 通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。Lu 等[6]研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ZD5 基因敲除的小鼠妊娠第10.5 天胎盤血管生成減少,胚胎死亡。但FZD5 在反芻動(dòng)物山羊圍著床期子宮中的表達(dá)與作用尚不清楚。本研究檢測FZD5 基因在山羊圍著床期子宮中的表達(dá)情況,為后續(xù)研究Wnt-FZD 信號(hào)系統(tǒng)在反芻動(dòng)物胚胎著床機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為改進(jìn)胚胎移植、克隆動(dòng)物等胚胎工程技術(shù)操作提供思路。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)選擇健康無疾病的未孕母羊27 只(黑龍江本地品種山羊)于黑龍江大慶銀浪羊場統(tǒng)一飼養(yǎng)。山羊的發(fā)情周期一般為17~25 d,平均為21 d,發(fā)情持續(xù)1~3 d。采用公羊試情法鑒定母羊是否發(fā)情,選取穩(wěn)定發(fā)情的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

    1.2.1 發(fā)情周期模型 采用公羊試情法判定山羊發(fā)情后,觀察記錄2 個(gè)發(fā)情周期。選取發(fā)情規(guī)律的山羊,在第3 次發(fā)情當(dāng)天,記為發(fā)情第0 天(ED0)。山羊發(fā)情期ED0、ED6、ED12、ED16 宰殺后30 min 之內(nèi)取出子宮,用PBS 清洗子宮表面存在的污物血跡,健康子宮組織,一部分液氮凍存,一部分固定石蠟包埋。每個(gè)時(shí)期取3只羊。

    1.2.2 早期妊娠模型 選擇發(fā)情規(guī)律的母山羊與公山羊配種,通過記錄的交配日期和監(jiān)控是否返情確定妊娠階段。如果沒有返情,則將最后1 次交配日期記錄為妊娠第0 天(D0),根據(jù)日期確定妊娠所處階段。分別于妊娠D0、D6、D16、D19、D25 處死動(dòng)物,取子宮組織。將子宮體分成小塊(每小塊上有明顯肉阜區(qū))放于液氮中保存,每個(gè)時(shí)期取3 只羊。

    1.2.3 類固醇激素處理模型 將健康母山羊的兩側(cè)卵巢切除,恢復(fù)2 個(gè)月康復(fù)后,分為 4 組進(jìn)行皮下注射類固醇激素,每組 3 只。油處理組(對(duì)照):1 mL 芝麻油/只;雌激素處理組:50 μg/(mL·只);孕酮處理組:500 mg/(mL·只);雌激素和孕酮共同處理組:500 mg 孕酮+50 μg 雌激素/(mL·只)。飼養(yǎng) 24 h 之后處死,取材方法同上。

    1.3 熒光定量PCR

    1.3.1 總RNA 提取及cDNA 合成 按照TRIzol?Reagent試劑說明書提取山羊子宮中總RNA,Nano Drop 2000測RNA 濃度及純度;將得到總RNA 進(jìn)行消化后Nano Drop 2000 測RNA 濃度及純度;按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit 試劑盒說明書操作采用兩步法合成第一鏈cDNA 并于-20℃冰箱保存。

    1.3.2 引物設(shè)計(jì)合成 按照Real-time PCR 引物原則,根據(jù)NCBI 提供的基因序列,用Premier 5 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)山羊FZD5 及內(nèi)參GAPDH 引物序列。

    表1 引物序列

    1.3.3 熒光定量PCR 使用SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)對(duì)妊娠D6(孕體黏附起始)、D16(孕體黏附與延長)、D19(黏附穩(wěn)固)的山羊子宮基因的表達(dá)情況進(jìn)行熒光定量PCR。用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測。反應(yīng)體系為25 μL:上下游引物(10 mol/L)各1 μL,SYBR?Premix Ex Taq(2×)12.5 μL,ROX 0.5 μL,cDNA 1 μL,Nuclease-free H2O 9 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃ 5 s,60℃ 34 s(采集信號(hào)),40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)cDNA 樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。由計(jì)算機(jī)根據(jù)擴(kuò)增曲線自動(dòng)分析得出Ct 值,以18S 為內(nèi)參。以公式2-ΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。利用GraphPad Prism 5 軟件統(tǒng)計(jì)組間差異并做圖。

    1.4 Western blot 收集子宮組織,加入冰預(yù)冷的蛋白裂解液,用勻漿器勻漿,冰上孵育30 min 后離心取上清液進(jìn)行蛋白定量。50 μg 蛋白沸水中煮5 min,上樣,SDS-PAGE 電泳,電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。轉(zhuǎn)移后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。之后與Frizzled-5兔源抗體(1∶500,bs-2930R,Bioss)4℃孵育過夜。PBST 液漂洗,再加入Mouse Anti-rabbit IgG/HRP(1∶2 000,bs-0295M,Bioss)37℃孵育1 h。PBST 洗3 次后,ECL試劑盒顯影。

    1.5 免疫組化 子宮組織經(jīng)中性福爾馬林固定液固定,然后脫水和包埋,制成石蠟切片(5 μm),二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水后,抗原修復(fù),加3%H2O2室溫孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS 洗滌后加封閉液(10%馬血清)37℃封閉1 h,滴加Frizzled-5 兔源抗體(1∶50),4℃孵育過夜,PBS 洗滌后滴加Mouse Anti-rabbit IgG/HRP(1∶100)于37℃孵育1 h,PBS 洗滌后加DAB 顯色、終止、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢照相。

    1.6 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)熒光定量所得到的Ct 值,采用2-ΔCt方法進(jìn)行結(jié)果處理。Western blot 結(jié)果使用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件掃描測定,重復(fù)3 次,其中FZD5 灰度值為FZD5 IOD 值與GAPDH IOD 值的比值。免疫組織化學(xué)切片用生物顯微鏡觀察并拍照。數(shù)據(jù)采用SPSS1 9.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn),結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05 表示差異顯著,P<0.01 表示差異極顯著。

    2 結(jié) 果

    2.1 FZD5 mRNA 在妊娠山羊圍著床期子宮中的表達(dá)圖1 顯示,F(xiàn)ZD5 mRNA 在妊娠D6 時(shí)表達(dá)最高,隨著黏附進(jìn)行,D16、D19 顯著低于D6 且表達(dá)規(guī)律呈下降趨勢。

    圖1 FZD5 mRNA 在圍著床期子宮中的表達(dá)

    2.2 FZD5 蛋白在山羊子宮中的表達(dá)

    2.2.1 FZD5 蛋白在山羊早期妊娠子宮中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果(圖2)顯示,在山羊妊娠D6,F(xiàn)ZD5 蛋白表達(dá)于子宮腔上皮、腺上皮中;在妊娠D16,F(xiàn)ZD5 蛋白在子宮腔上皮和腺上皮中同樣檢測到信號(hào)且表達(dá)低于D6;在妊娠D19,F(xiàn)ZD5 蛋白表達(dá)較低。

    圖2 圍著床期山羊子宮組織中FZD5 蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(200×)

    圖3 FZD5 蛋白的Western blot 檢測結(jié)果

    Western blot 結(jié)果顯示(圖3-A),山羊妊娠(D6、D16、D19 和D25)子宮中均檢測到FZD5 蛋白表達(dá)。在妊娠D6、D16 時(shí)FZD5 表達(dá)均高于D19 和D25(P<0.05),D6、D16 之間差異不顯著,D19 和D25 之間差異不顯著。表明FZD5 在妊娠早期(D6、D16)表達(dá)高于胚胎黏附完成(D19)和胎盤發(fā)生的早期(D25),推測FZD5 蛋白參與山羊孕體著床過程。

    2.2.2 FZD5 蛋白在山羊發(fā)情周期子宮中的表達(dá) 如圖3-B所示,在山羊發(fā)情周期(ED0、ED6、ED12 和ED16)的子宮中均有FZD5 蛋白表達(dá),但表達(dá)無顯著差異。

    2.3 FZD5 蛋白在類固醇激素處理子宮中的表達(dá) 如圖3-C 所示,與Oil 處理組相比較,孕酮處理組FZD5 蛋白表達(dá)降低極顯著(P<0.01);雌激素處理組FZD5蛋白表達(dá)下降但并不顯著;雌激素和孕酮共同處理組FZD5 蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。這一結(jié)果表明,孕酮抑制FZD5 蛋白的表達(dá),雌激素對(duì)抑制FZD5 蛋白的表達(dá)不顯著。

    3 討 論

    胚胎著床的方式分為侵入型和非侵入型著床,山羊?qū)儆诜乔秩胧街?,與小鼠相比,山羊子宮內(nèi)膜不進(jìn)行蛻膜化且孕體與子宮腔上皮黏附,同時(shí)還伴隨著孕體在子宮腔內(nèi)的延長,使山羊整個(gè)黏附過程持續(xù)時(shí)間較長,所以山羊是研究胚胎黏附的良好模型。在山羊早期妊娠中,第6 天囊胚進(jìn)入子宮腔并從透明帶中孵出,隨后孕體在子宮腔內(nèi)開始延長;妊娠第14 天時(shí),孕體開始分泌妊娠識(shí)別信號(hào)干擾素-tau(interferon-tau,IFNT),IFNT 能夠阻礙黃體溶解,繼續(xù)產(chǎn)生孕酮[7-8]。在孕酮作用下孕體延長并與子宮肉阜的上皮細(xì)胞粘附;妊娠第16~17 天,胚胎粘附廣泛發(fā)生,IFNT 分泌達(dá)到峰值,在第20 天分泌水平降低;第19 天孕體與子宮肉阜處子宮內(nèi)膜建立穩(wěn)固黏附;隨著妊娠進(jìn)行,在孕體和子宮肉阜粘附處,組織增生血管發(fā)生,逐漸形成子葉狀胎盤[9]。

    在胚胎著床過程中,Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過直接開啟和關(guān)閉大量的基因,如C-MYC、CYCLIN-D1、HOX A-10/11、環(huán)氧合酶-2(COX-2)基因等,以及與其他信號(hào)通路共同作用調(diào)節(jié)胚胎著床過程和胚胎發(fā)育[10]。Sonderegger 等[11]研究發(fā)現(xiàn),重組配體Wnt3a 處理人滋養(yǎng)層細(xì)胞可激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路,引起基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)分泌,有助于促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞在子宮內(nèi)膜的遷移和侵襲;Carmon 等[12]研究顯示,在人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中,高水平FZD5 與Wnt7a 結(jié)合顯示激活β-catenin 經(jīng)典Wnt 信號(hào)并增加上皮細(xì)胞增殖。有研究表明,F(xiàn)ZD5 是分泌的卷曲相關(guān)蛋白(Secreted Frizzled-related Proteins,SFRPs)的受體,并通過內(nèi)皮細(xì)胞中的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/ NFATc3 途徑介導(dǎo)SFRP2誘導(dǎo)的血管生成[13]。本研究結(jié)果顯示,山羊孕體黏附之前,F(xiàn)ZD5 表達(dá)較高,提示FZD5 可能參與子宮腔上皮的增殖。胚胎伸展黏附期結(jié)束后,在妊娠第25 天,F(xiàn)ZD5 表達(dá)上升,可能參與后續(xù)的血管發(fā)生胎盤形成過程。已有研究表明,在小鼠中胚胎著床“窗口”期子宮內(nèi)膜β-catenin 蛋白表達(dá)暫時(shí)性下調(diào)或缺失,有利于促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分化來同步植入前胚胎的發(fā)育[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在山羊胚胎黏附期,Wnt 受體FZD5 的表達(dá)也下調(diào),F(xiàn)ZD5 可能參與孕體與山羊子宮腔上皮的黏附過程。

    孕酮能夠激活和維持子宮內(nèi)膜功能,是孕體生長、植入、胎盤形成以及后期發(fā)育所必需。反芻動(dòng)物妊娠早期孕體分泌IFNT 阻礙黃體退化,使母體處于較高的孕酮水平。肉牛、奶牛和綿羊排卵后高濃度孕酮水平能夠增加孕體長度;在牛的妊娠周期子宮中孕酮誘導(dǎo)子宮內(nèi)環(huán)境改變,支持囊胚生長成卵形狀和延伸成纖維狀孕體[15-16]。孕酮通過影響子宮內(nèi)膜作用于胚胎生長和孕體延長,孕酮誘導(dǎo)子宮上皮細(xì)胞分泌增殖因子(GRP)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SLC5A11)、分泌型黏附蛋白(SPP1),鈣/磷酸鹽穩(wěn)態(tài)的候選調(diào)節(jié)劑(STC1)和免疫調(diào)節(jié)因子等。這些基因進(jìn)一步受到胚胎來源的IFNT 和皮質(zhì)醇的刺激,導(dǎo)致妊娠期子宮腔液成分改變,進(jìn)而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和遷移,調(diào)節(jié)胎體伸長[17-18]。本實(shí)驗(yàn)中,孕酮處理導(dǎo)致山羊子宮中FZD5 蛋白表達(dá)極顯著降低,孕酮可以通過調(diào)控FZD5 影響Wnt 信號(hào)通路影響妊娠的相關(guān)分子事件。

    4 結(jié) 論

    FZD5 蛋白定位于山羊子宮腔上皮和腺上皮中;在山羊妊娠早期過程中,胚胎黏附之前FZD5 mRNA 和蛋白表達(dá)水平較高,黏附期表達(dá)水平逐漸下降。在山羊發(fā)情周期中FZD5 蛋白表達(dá)無明顯差異;孕酮下調(diào)山羊子宮中FZD5 蛋白表達(dá)。FZD5 在山羊早期妊娠子宮中的表達(dá)具有胚胎著床特異性,胚胎黏附期FZD5 下調(diào)有利于山羊黏附過程,且FZD5 蛋白表達(dá)受孕酮影響下調(diào)。本研究為山羊著床機(jī)制提供研究實(shí)驗(yàn)依據(jù),為提高反芻動(dòng)物的繁殖力,為提高胚胎工程操作技術(shù)的效率提供研究思路。

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