• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    類烏齊牦牛SIRT3基因克隆與生物信息學及差異表達分析

    2019-06-18 01:20:00楊玉梅柴志欣王吉坤信金偉姬秋梅鐘金城
    中國畜牧雜志 2019年6期
    關鍵詞:乙?;?/a>牦牛結(jié)構(gòu)域

    楊玉梅,柴志欣,王 會,王吉坤,信金偉,姬秋梅,鐘金城*

    (1.西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室,四川成都 610041;2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室,西藏拉薩 850009)

    哺乳動物的沉默信號調(diào)節(jié)因子(The Silent Information Regulator,Sirtuin)家族是酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2(SIR2)的同源蛋白質(zhì),是一種高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD+)依賴的去乙酰化酶,廣泛存在于原核生物和真核生物,具有7 個家族成員SIRT1-7[1-2]。沉默信號調(diào)節(jié)因 子3(Silent Mating Type Information Regulation 3,SIRT3)主要定位于線粒體,調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)的細胞活力及能量代謝[3]。對缺失SIRT3 的小鼠進行饑餓試驗,48 h 后發(fā)現(xiàn)肝臟和血漿中的脂肪堆積異常且棕櫚酸的氧化速率降低,脂肪酸β- 氧化發(fā)生障礙[4];在棕色脂肪細胞分化過程中會存在SIRT3 的誘導表達[5],白藜蘆醇能上調(diào)肝細胞SIRT3 的表達與活性,改善肝細胞線粒體功能,減輕肝細胞氧化應激損傷[6]。以上研究表明,SIRT3 對調(diào)節(jié)肝細胞氧化代謝及脂肪代謝發(fā)揮重要作用。

    牦牛是青藏高原畜牧業(yè)發(fā)展的主要畜種,為當?shù)啬撩裉峁┵囈陨娴纳a(chǎn)和生活資料。類烏齊因其氣候宜人,植被豐富,俗稱“西藏小瑞士”。類烏齊牦牛遺傳多樣性豐富,保持了“原生態(tài)、純天然、全綠色”等特點,肉質(zhì)鮮美,致密有彈性,富含蛋白質(zhì)和氨基酸,口味濃郁,營養(yǎng)價值高,保持了“原生態(tài)、純天然、全綠色”等特點,2018 年正式公布成為國家優(yōu)良牦牛遺傳資源。本實驗通過對類烏齊牦牛SIRT3 基因的克隆與生物信息學等研究,為進一步探討影響類烏齊牦牛肝臟組織中脂肪代謝的主要影響因素提供基礎資料。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 樣品采集于西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣,選取3 頭4.5 歲健康雌性類烏齊牦牛,分別采集肝臟、心臟、臀大肌組織,立即用滅菌DEPC 水沖洗,置于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 方法

    1.2.1 引物設計 參考GenBank 普通牛SIRT3 基因序列(NM_001206669.1),使用Primer premier5.0 設計引物(表1),由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成。

    1.2.2 總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄 選取類烏齊牦牛肝臟組織用于克隆,用Trizol 法提取肝臟組織的總RNA,用分光光度計檢測RNA 濃度,電泳檢測RNA 完整性并分裝保存于-80℃。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)說明書步驟將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

    1.2.3 SIRT3 基因PCR 擴增 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,PCR 擴增體系(25 μL):cDNA(20 ng/μL)1 μL,上、下游引物(10 pmol/mL)各1 μL,無菌去離子水 9.5 μL,Taq Green PCR Master Mix 12.5 μL。PCR 反應程序:95℃ 4 min 預變性;94℃ 40 s,64℃ 45 s,72℃ 70 s,共34 個循環(huán);72℃延伸10 min。

    1.2.4 QPCR 分析 反應體系10 μL: SYBR premix Dimer Eraser(2x)5 μL,上、下引物(10 pmol/mL)各0.4 μL,無菌去離子水3.2 μL,cDNA(20 ng/μL)1 μL。定量程序:95℃預變性30 s,95℃ 5 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,40個循環(huán)。分別取3 頭牦牛的心臟、肝臟、臀大肌組織進行定量分析,每個組織3 個重復。反應結(jié)束后以熔解曲線來判定QPCR 反應的特異性,獲得每個樣品的CT 值,采用2-ΔΔCT法,GAPDH 作為內(nèi)參基因?qū)颖径拷Y(jié)果進行處理,計算各個樣本的相對表達水平,每組重復取平均值。利用SPSS 16.0 軟件對SIRT3 基因在不同組織器官的表達水平進行單因素方差分析,P<0.05 為差異顯著,P<0.01 為差異極顯著。

    1.3 目的基因克隆 純化回收后的PCR 產(chǎn)物與PMD19-T載體16℃過夜連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆,送擎科生物科技有限公司測序。

    1.4 生物信息學分析 將所得序列進行BLAST 比對分析,利用Clustalx 和Mega5.0 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,DNASTAR 進行同源性分析。利用在線軟件ExPASy、SWISSMODEL 相關程序分析SIRT3 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征。利用SignaIP 4.1、TMpred、PSORT Ⅱ軟件預測SIRT3 基因的功能。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 牦牛SIRT3 基因的RT-PCR 擴增 根據(jù)PCR 擴增結(jié)果,目的條帶與預期大小一致(圖1)。類烏齊牦牛SIRT3 基因CDS 區(qū)長1 002 bp,共編碼333 個氨基酸。牦牛與普通牛(NM_001206669.1)SIRT3 基因CDS 區(qū)對比發(fā)現(xiàn),存在6 個突變位點(49、279、342、384、149、620 bp),分別導致密碼子TTG→CTG(亮氨酸)、CCA→CCG( 脯 氨 酸)、GAA→GAG( 谷 氨酸)、TTC→TTT(亮氨酸),以上均為同義突變;GGC→GAC(甘氨酸變成天冬氨酸)、GTG→GCG(纈氨酸變成丙氨酸)為錯義突變(圖2)。

    圖1 牦牛SIRT3 基因RT-PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖

    表1 類烏齊牦牛SIRT3 基因的引物序列

    2.2 SIRT3 蛋白理化性質(zhì)分析 使用ProtParam 預測,SIRT3 基因編碼蛋白含負電荷殘基總數(shù)(天冬氨酸+谷氨酸)33 個,正電荷殘基總數(shù)(精氨酸+ 賴氨酸)39 個,正負殘基含量相差較小。SIRT3 蛋白分子質(zhì)量為36 961.69 u,等電點(PI)為9.00,其不穩(wěn)定指數(shù)為36.34,屬穩(wěn)定蛋白,脂肪指數(shù)為91.95,親水系數(shù)(GRAVY)為-0.036,表現(xiàn)為親水性。疏水性分析顯示,多肽鏈第77 位纈氨酸分值最高(2.689),第196 位酪氨酸分值最低(-2.044),整個肽鏈在尾部呈親水性,為可溶性蛋白。

    2.3 SIRT3 蛋白功能預測

    2.3.1 跨膜結(jié)構(gòu)域預測 利用TMpred 和SignalP 4.1 預測SIRT3 蛋白跨膜區(qū)域,存在多個跨膜區(qū)域,最優(yōu)跨膜拓撲結(jié)構(gòu)僅一處位于其內(nèi)部N 端(29~49 aa),同時TM- 螺旋長度預測在17~33 aa。不含信號肽,屬非分泌性蛋白。

    圖3 類烏齊牦牛SIRT3 蛋白磷酸化位點預測

    2.3.2 磷酸化位點預測 使用NetPhos 3.1 Server 預測SIRT3 基因編碼序列的磷酸化位點,共發(fā)現(xiàn)23 個磷酸化位點,包含14 個絲氨酸磷酸化位點和9 個蘇氨酸磷酸化位點(圖3)。亞細胞定位發(fā)現(xiàn),牦牛成熟SIRT3蛋白主要存在于線粒體(69.6%),部分存在于細胞質(zhì)(17.4%)、細胞核(8.7%)及細胞骨架(4.3%)。

    圖2 類烏齊牦牛SIRT3 基因與普通牛CDS 區(qū)比對

    圖4 類烏齊牦牛SIRT3 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

    圖5 類烏齊牦牛與其他物種SIRT3 氨基酸比對

    圖6 類烏齊牦牛SIRT3 預測二級結(jié)構(gòu)

    2.3.3 保守結(jié)構(gòu)域預測 使用NCBI 預測SIRT3 蛋白的保守區(qū)域。由圖4 可知,該蛋白屬SIR2 蛋白超家族結(jié)構(gòu)域,包括Sir2 酶,其催化NAD+依賴性蛋白質(zhì)/組蛋白脫乙?;?,其中來自賴氨酸ε-氨基的乙?;D(zhuǎn)移至NAD +的ADP-核糖部分,產(chǎn)生煙酰胺和代謝產(chǎn)物O-乙酰基-ADP-核糖。SIRT1 結(jié)構(gòu)域,包括人SIRT1-3和酵母Hst1-4,屬于SIR2 蛋白家族成員,Sir2 酶催化NAD+ 依賴性蛋白質(zhì)/ 組蛋白脫乙?;?。同時,包含14 個NAD + 結(jié) 合 位 點(80、82、83、90、91、143、161、162、164、181、252、257、278、279、298),11 個底物結(jié)合位點(163、181、225、227、228、229、230、231、256、257、258)和4 個Zn 結(jié)合位點(189、192、213、216)。

    2.3.4 功能結(jié)構(gòu)域預測 使用Clustal W 2.1 Version 分析發(fā)現(xiàn),類烏齊牦牛SIRT3 蛋白包含保守KIV 與GIP 功能區(qū)域(圖5),是基因沉默必不可少的核心區(qū)域。利用Psipred 的FFpred 預測蛋白質(zhì)功能,該蛋白在含磷酸化合物代謝、線粒體組織、小分子代謝及調(diào)節(jié)代謝等一系列生物合成過程中發(fā)揮調(diào)控作用,其中在催化活性、核苷酸結(jié)合及輔因子結(jié)合等過程中發(fā)揮主要作用(表2)。

    2.3.5 高級結(jié)構(gòu)預測 使用SOPMA 預測類烏齊牦牛SIRT3 蛋白二級結(jié)構(gòu),其中α-螺旋和無規(guī)卷曲為二級結(jié)構(gòu)主要組成部分,分別占35.44%和44.44%,延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角分別占13.81%和6.31%(圖6),牦牛SIRT3 基因編碼蛋白為混合類蛋白質(zhì)。使用SWISSMODEL 預測其三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成,含少量β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈。該結(jié)果與SOPMA軟件預測類烏齊SIRT3 蛋白二級結(jié)構(gòu)一致(圖7)。

    2.5 同源性分析及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 利用ClustalX 和MAGA5.2 構(gòu)建類烏齊牦牛與普通牛(Bos taurus)、山羊(Capra hircus)、野豬(Sus scrofa)、家貓(Felis catus)、人(Homo sapiens)、家兔(Oryctolagus cuniculus)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)和斑馬魚(Danio rerio)SIRT3 基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明,類烏齊牦牛與普通牛親緣關系最近,與斑馬魚親緣關系最遠(圖8)。用DNASTAR 的MegAlign 對類烏齊牦牛進行一致性分析,發(fā)現(xiàn)類烏齊牦牛與普通牛、山羊、野豬、家貓、人、家兔、小鼠、大鼠、斑馬魚的一致性分別為99.4%、96.8%、89.7%、78.4%、82.1%、79.5%、81.5%、82.7%、59.9%,其分析結(jié)果與物種間親緣關系理論一致(圖9)。

    2.6 QPCR 分析 由圖10 可知,SIRT3 基因在類烏齊牦牛肝臟組織中的表達水平顯著高于其他組織(P<0.01),心臟組織與臀大肌組織中的表達水平差異不顯著。

    表2 SIRT3 基因功能分析結(jié)果

    3 討 論

    3.1 類烏齊牦牛SIRT3 基因分子特性分析 線粒體是細胞內(nèi)進行脂肪酸氧化代謝的核心細胞器,線粒體中脂肪酸氧化是脂肪消耗的主要方式,相關研究顯示,3T3L1細胞分化后用抗霉素處理,抑制線粒體的氧化呼吸可顯著促進細胞內(nèi)脂質(zhì)的積累,說明線粒體的功能與脂肪沉積存在重要關系[7]。脂肪細胞分化需大量ATP,成脂分化前期,線粒體進行氧化磷酸化可產(chǎn)生脂肪細胞分化過程中所需的大量ATP。研究發(fā)現(xiàn),許多線粒體蛋白賴氨酸的乙?;癄顟B(tài)均是由SIRT3 基因調(diào)節(jié)[8-9],線粒體蛋白賴氨酸乙?;钦{(diào)節(jié)脂肪代謝的重要途徑,而其乙?;皆诤艽蟪潭壬先Q于NAD+依賴性去乙酰化酶[10]。對于已經(jīng)成脂分化的3T3L1 細胞,通過基因轉(zhuǎn)染過表達SIRT3 可顯著減少細胞內(nèi)線粒體數(shù)量,而抑制SIRT3的表達則會增加細胞內(nèi)線粒體數(shù)量[11]。

    圖7 類烏齊牦牛SIRT3 蛋白三級結(jié)構(gòu)的預測

    圖8 用鄰接(NJ)法對類烏齊牦牛與其他品種間SIRT3 基因序列構(gòu)建的進化樹

    圖9 類烏齊牦牛SIRT3 同源性分析

    圖10 牦牛SIRT3 基因的mRNA 組織表達分析

    Sirtuin 家族的催化核心由NAD+ 結(jié)合域和小亞結(jié)構(gòu)域組成,NAD+ 結(jié)合域由Rossman 折疊構(gòu)成,是許多NAD+ 和NADP 結(jié)合酶的特征域;小亞結(jié)構(gòu)域包括一個螺旋構(gòu)件和一個鋅結(jié)合[12]。大小結(jié)構(gòu)域之間形成了一個裂隙,為NAD+ 提供了結(jié)合位點,乙?;脑谶@個裂縫里結(jié)合形成酶- 底物的β- 折疊結(jié)構(gòu)而發(fā)生催化反應[13]。本研究中類烏齊牦牛SIRT3 蛋白包含SIR2蛋白超家族結(jié)構(gòu)域和SIRT1 結(jié)構(gòu)域,這與Sirtuin 家族基本結(jié)構(gòu)吻合。類烏齊牦牛SIRT3 基因氨基酸序列發(fā)現(xiàn)2 個特異性保守結(jié)構(gòu)域KIV 和GIP,是SIRT3 蛋白調(diào)控基因沉默的關鍵功能結(jié)構(gòu)域[14],與人SIRT3 蛋白具有相似的功能,說明不同物種SIRT3 蛋白結(jié)構(gòu)的相似性較大。亞細胞定位和功能分析顯示,類烏齊牦牛SIRT3蛋白位于線粒體,該蛋白在含磷酸化合物代謝、線粒體組織及調(diào)節(jié)代謝等生物合成過程發(fā)揮作用,但在催化活性、核苷酸結(jié)合及輔因子結(jié)合等過程發(fā)揮主要作用。就目前研究而言,紅鰭東方鲀SIRT3 蛋白功能對中央中介代謝、翻譯、脂肪酸代謝和輔因子生物合成等過程發(fā)揮調(diào)控作用[10],與本研究在脂肪代謝和輔因子結(jié)合等過程發(fā)揮調(diào)控作用相同,說明該基因具有保守性,但魚類與家畜在遺傳機制、遺傳基礎、身體構(gòu)造及所處環(huán)境有較大差異,該蛋白調(diào)控過程存在差異也屬正常。

    3.2 SIRT3 蛋白所含氨基酸分析 目前,對SIRT3 基因的研究主要集中在人、小鼠、豬和牛等,對牦牛SIRT3 基因的研究鮮有報道。本實驗發(fā)現(xiàn),類烏齊牦牛SIRT3 基因CDS 區(qū)長1 002 bp,編碼333 個氨基酸,這與牛SIRT3基因CDS 區(qū)長1 002 bp,共編碼333 個氨基酸的結(jié)果相同[15],與紅鰭東方鲀SIRT3 基因CDS 區(qū)長1 263 bp、編碼420 個氨基酸的結(jié)果差異較小[16],說明SIRT3 基因在進化過程中相對保守。

    與普通牛比對,類烏齊牦牛SIRT3 基因CDS 區(qū)存在甘氨酸突變成天冬氨酸、纈氨酸突變?yōu)楸彼? 處錯義突變。天冬氨酸是生物體內(nèi)多種氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體,作為生物體內(nèi)氨基提供者參與許多代謝途徑[17],這也成為SIRT3 基因在不同組織線粒體中發(fā)揮作用的物質(zhì)保障。SIRT3 可去乙酰化激活乙酰-Co A 合成酶(Ace CS2),Ace CS2 是一個線粒體酶,可以利用乙酸鹽、Co A 和ATP 生成乙酰-Co A,乙酰-Co A 是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,也是膽固醇和脂肪酸合成的主要底物[18]。天冬氨酸可介導還原當量通過線粒體膜的轉(zhuǎn)移,進而調(diào)控細胞的糖酵解和氧化還原狀態(tài),還可通過合成天冬酰胺調(diào)節(jié)免疫功能[19-20],是類烏齊牦牛的能量代謝及提高免疫的重要物質(zhì)基礎,還可作為K+、Mg2+

    的載體向心肌輸送電解質(zhì),從而改善心肌收縮功能,同時降低氧消耗,在冠狀動脈循環(huán)障礙缺氧時,對心肌有保護作用。牦牛生活在高原缺氧環(huán)境,天冬氨酸可保護牦牛的心肌有利于其在極端環(huán)境生存。而丙氨酸可協(xié)助葡萄糖代謝,補充類烏齊牦牛在溫差較大的高原環(huán)境所需能量。在氨基酸對豬小腸上皮細胞抗菌肽和信號通路蛋白表達影響的研究中發(fā)現(xiàn),用丙氨酸處理可顯著提高Sirt1 的表達水平[21],飼糧中添加適量β-丙氨酸能改善肉仔雞肉品質(zhì)[22],SIRT3 基因部分位點突變可能是其肉質(zhì)鮮美的影響因素。而秦川牛SIRT3 基因發(fā)現(xiàn)第5外顯子22522 C>T 突變,與其部分體尺、肉品質(zhì)性狀極顯著相關[23],與本研究結(jié)果突變位點一致,可進一步進行該基因突變位點與牦牛體尺及肉品質(zhì)性狀的相關性分析。

    3.3 類烏齊牦牛SIRT3 基因表達分析 SIRT3 基因在臀大肌中表達水平最低,在肝臟組織中的表達水平最高。肝臟作為機體主要代謝器官,肝臟中SIRT3 不僅參與脂肪酸的合成和分解代謝,也參與調(diào)控饑餓條件下酮體生成;肝臟中SIRT3 還可調(diào)控尿素循環(huán),促進細胞內(nèi)氨基酸代謝生成氨的解毒作用。SIRT3 在肝臟中主要參與物質(zhì)的氧化分解,為細胞生理活動提供ATP,抑制富余營養(yǎng)物質(zhì)如脂肪酸等在肝臟中的積累。結(jié)果顯示,與物質(zhì)和能量代謝密切相關的SIRT3 在肝臟、心臟及肌肉等代謝旺盛的組織中表達量相對較高[24],這與在豬SIRT3 肝臟組織中表達水平最高的結(jié)果相似[10]。同時在禁食期間,與野生型小鼠相比,敲除SIRT3 小鼠的脂肪酸代謝中間產(chǎn)物的濃度發(fā)生異常,肝臟中甘油三酯也明顯增多,但其在肝臟中的脂肪酸吸收以及分解作用正常[25],這也從側(cè)面說明SIRT3 基因在維持肝臟中脂肪正常代謝發(fā)揮重要作用。

    4 結(jié) 論本研究顯示,類烏齊牦牛SIRT3 基因編碼區(qū)在生物進化中具有較高保守性,SIRT3 基因在肝臟、心臟、臀大肌均表達,且在肝臟中的表達量最高,為進一步闡明SIRT3 基因在肝臟組織中脂肪代謝奠定基礎。

    猜你喜歡
    乙?;?/a>牦牛結(jié)構(gòu)域
    抑癌蛋白p53乙?;揎椀恼{(diào)控網(wǎng)絡
    美仁大草原的牦牛(外一章)
    散文詩(2021年22期)2022-01-12 06:13:54
    跟著牦牛去巡山
    蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域劃分方法及在線服務綜述
    目前牦??谔阋叩脑\斷與防治
    重組綠豆BBI(6-33)結(jié)構(gòu)域的抗腫瘤作用分析
    中國組織化學與細胞化學雜志(2016年4期)2016-02-27 11:15:53
    組蛋白甲基化酶Set2片段調(diào)控SET結(jié)構(gòu)域催化活性的探討
    組蛋白去乙?;敢种苿┑难芯窟M展
    泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與泛素化信號的識別
    日韩一本色道免费dvd| 久久久久久久久久久免费av| 国产欧美日韩精品一区二区| av在线老鸭窝| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产探花极品一区二区| 久久久久久九九精品二区国产| 九九在线视频观看精品| 国产极品天堂在线| 日韩大片免费观看网站 | 精品午夜福利在线看| 久久久精品欧美日韩精品| 免费搜索国产男女视频| 精品无人区乱码1区二区| 久久精品国产亚洲av天美| 99热这里只有是精品50| 欧美不卡视频在线免费观看| 只有这里有精品99| 国产高清视频在线观看网站| 好男人视频免费观看在线| 99在线视频只有这里精品首页| 免费看日本二区| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲色图av天堂| ponron亚洲| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产一区二区三区av在线| 精品午夜福利在线看| 欧美激情在线99| 国产精品一区www在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久这里只有精品中国| 偷拍熟女少妇极品色| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美激情国产日韩精品一区| 永久免费av网站大全| eeuss影院久久| 长腿黑丝高跟| 午夜免费激情av| 男插女下体视频免费在线播放| 黄色日韩在线| 少妇丰满av| 男女边吃奶边做爰视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品久久久久久久久免| 国产亚洲精品av在线| 熟女电影av网| 黑人高潮一二区| 午夜福利在线观看吧| 国产精品蜜桃在线观看| 久久久久国产网址| 久久久久精品久久久久真实原创| 综合色av麻豆| a级毛色黄片| 国产在线男女| 人人妻人人澡欧美一区二区| 一夜夜www| 99热这里只有是精品在线观看| av线在线观看网站| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 久久99热这里只有精品18| 欧美一区二区亚洲| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 午夜久久久久精精品| 内射极品少妇av片p| av在线蜜桃| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久精品影院6| 一个人观看的视频www高清免费观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲在线观看片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品一区二区性色av| 精华霜和精华液先用哪个| 丰满乱子伦码专区| 大香蕉97超碰在线| 国产日韩欧美在线精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 免费观看a级毛片全部| 一级毛片电影观看 | 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 边亲边吃奶的免费视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 1024手机看黄色片| 亚洲av成人精品一区久久| 黄色配什么色好看| 精华霜和精华液先用哪个| 国产亚洲最大av| 99久久精品国产国产毛片| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲成色77777| 看非洲黑人一级黄片| 丰满乱子伦码专区| 三级国产精品片| 精品久久久噜噜| 黄色日韩在线| 日韩制服骚丝袜av| 六月丁香七月| 级片在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 美女黄网站色视频| 一级毛片我不卡| 久久久久网色| 天堂网av新在线| av天堂中文字幕网| 色综合亚洲欧美另类图片| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久人人爽人人片av| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲成人av在线免费| 少妇人妻一区二区三区视频| 综合色丁香网| 国产91av在线免费观看| 天天一区二区日本电影三级| 免费观看a级毛片全部| av在线天堂中文字幕| 午夜爱爱视频在线播放| 免费av观看视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 精品久久久久久电影网 | 国产又色又爽无遮挡免| 神马国产精品三级电影在线观看| av免费在线看不卡| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲图色成人| 欧美不卡视频在线免费观看| 日日撸夜夜添| 男插女下体视频免费在线播放| 直男gayav资源| 日韩国内少妇激情av| 久久精品人妻少妇| 国产亚洲最大av| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美极品一区二区三区四区| 三级经典国产精品| 国产成人91sexporn| 欧美zozozo另类| 免费看av在线观看网站| www.av在线官网国产| 村上凉子中文字幕在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 日韩一区二区三区影片| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品国产高清国产av| 中文欧美无线码| 国产一区二区在线av高清观看| 一本一本综合久久| 麻豆成人av视频| 国产不卡一卡二| 国模一区二区三区四区视频| 国产又色又爽无遮挡免| 精品一区二区免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 91狼人影院| 黄片wwwwww| 亚洲国产最新在线播放| 少妇的逼水好多| av免费观看日本| 六月丁香七月| 亚洲成av人片在线播放无| 国产 一区精品| 精品久久久久久电影网 | 久久热精品热| 亚洲精品影视一区二区三区av| av在线老鸭窝| 日本午夜av视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久久欧美国产精品| eeuss影院久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 99久久精品一区二区三区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 久久99热这里只频精品6学生 | 成人三级黄色视频| 亚洲av免费高清在线观看| 国产在线男女| 我的女老师完整版在线观看| 午夜精品在线福利| 亚洲欧美日韩东京热| 国产私拍福利视频在线观看| 女人被狂操c到高潮| h日本视频在线播放| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 熟女电影av网| 日本爱情动作片www.在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 22中文网久久字幕| 久久韩国三级中文字幕| 中文字幕av在线有码专区| 久久精品国产自在天天线| 午夜免费激情av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品,欧美在线| 人妻少妇偷人精品九色| 色网站视频免费| 国产一区二区亚洲精品在线观看| av线在线观看网站| 中文欧美无线码| 一级毛片我不卡| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 色吧在线观看| 91精品国产九色| 高清午夜精品一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频| 看片在线看免费视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲成人久久爱视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产黄a三级三级三级人| 又爽又黄无遮挡网站| 人体艺术视频欧美日本| 一夜夜www| 午夜精品一区二区三区免费看| 免费看a级黄色片| 丰满少妇做爰视频| 欧美+日韩+精品| 亚洲av免费在线观看| 国产乱来视频区| 波野结衣二区三区在线| 18禁在线播放成人免费| 欧美97在线视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o | 欧美xxxx性猛交bbbb| 九草在线视频观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产在视频线在精品| 男人舔奶头视频| 97热精品久久久久久| 日韩欧美在线乱码| 国产一区亚洲一区在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美激情在线99| 国产精品野战在线观看| 亚洲av.av天堂| 久久精品国产亚洲网站| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲精品国产av成人精品| 中文资源天堂在线| 天堂√8在线中文| 亚洲av不卡在线观看| 我的老师免费观看完整版| 国产黄片视频在线免费观看| 97超碰精品成人国产| 亚洲伊人久久精品综合 | 我的老师免费观看完整版| 69av精品久久久久久| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 大话2 男鬼变身卡| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美+日韩+精品| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产av一区在线观看免费| 亚洲真实伦在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 三级经典国产精品| 69人妻影院| 99热精品在线国产| 国产成年人精品一区二区| 免费看日本二区| 在线观看av片永久免费下载| 99久久精品国产国产毛片| 黄色配什么色好看| 亚洲av一区综合| 欧美97在线视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久99热6这里只有精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成人一区二区视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 91aial.com中文字幕在线观看| 久久久色成人| 精品熟女少妇av免费看| 精品免费久久久久久久清纯| 国产午夜精品论理片| 亚洲18禁久久av| 特大巨黑吊av在线直播| 日日啪夜夜撸| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费av不卡在线播放| 综合色丁香网| 国产午夜精品论理片| 一边亲一边摸免费视频| 久久久a久久爽久久v久久| 26uuu在线亚洲综合色| 在线免费观看不下载黄p国产| 在线天堂最新版资源| 日日摸夜夜添夜夜爱| 97超碰精品成人国产| 高清av免费在线| 精品久久久久久久久久久久久| 美女大奶头视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 天堂中文最新版在线下载 | 国产精品久久久久久精品电影| 欧美丝袜亚洲另类| 波多野结衣高清无吗| 国内精品宾馆在线| 久久精品91蜜桃| 色播亚洲综合网| 日韩成人伦理影院| 乱人视频在线观看| 中文资源天堂在线| 我要看日韩黄色一级片| 国产激情偷乱视频一区二区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产乱人偷精品视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲人与动物交配视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 简卡轻食公司| 22中文网久久字幕| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日本一二三区视频观看| 日本黄色视频三级网站网址| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜视频国产福利| 久久久久久久午夜电影| 免费一级毛片在线播放高清视频| 天堂√8在线中文| 男女那种视频在线观看| 美女黄网站色视频| 亚洲av成人精品一区久久| 免费av毛片视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲精品自拍成人| 亚洲人与动物交配视频| 午夜日本视频在线| 国产精品国产三级国产专区5o | 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲欧洲国产日韩| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品久久久久久久久亚洲| 久久精品久久久久久久性| 男女啪啪激烈高潮av片| 人妻系列 视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 乱系列少妇在线播放| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲成色77777| 六月丁香七月| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 日韩 亚洲 欧美在线| 我的老师免费观看完整版| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产免费一级a男人的天堂| 大香蕉97超碰在线| 男的添女的下面高潮视频| 简卡轻食公司| 国产极品天堂在线| 免费看日本二区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 蜜桃久久精品国产亚洲av| eeuss影院久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲国产精品专区欧美| videos熟女内射| 日日撸夜夜添| 成人综合一区亚洲| 国产成人福利小说| 秋霞伦理黄片| 99九九线精品视频在线观看视频| 麻豆成人av视频| 嫩草影院新地址| 搞女人的毛片| 久久精品久久精品一区二区三区| 大香蕉久久网| 美女内射精品一级片tv| 女人久久www免费人成看片 | 午夜福利高清视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 日日啪夜夜撸| 一级av片app| 久久国产乱子免费精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 热99在线观看视频| 又爽又黄a免费视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 99热这里只有是精品50| 久久久久久久午夜电影| 国产伦在线观看视频一区| 日本av手机在线免费观看| 国产毛片a区久久久久| 99国产精品一区二区蜜桃av| 波野结衣二区三区在线| 亚洲av免费高清在线观看| 国产高潮美女av| 国产中年淑女户外野战色| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品国产三级国产专区5o | 真实男女啪啪啪动态图| 男女边吃奶边做爰视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产极品天堂在线| 成人亚洲精品av一区二区| 日韩制服骚丝袜av| 欧美97在线视频| 欧美性猛交黑人性爽| 久久久久免费精品人妻一区二区| 69人妻影院| 免费av不卡在线播放| 美女cb高潮喷水在线观看| 天堂中文最新版在线下载 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲性久久影院| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| videos熟女内射| 少妇的逼好多水| 97超碰精品成人国产| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美日韩综合久久久久久| 日本一二三区视频观看| 午夜日本视频在线| 中文字幕制服av| 免费av毛片视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲无线观看免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 大香蕉久久网| 毛片女人毛片| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久草成人影院| www.色视频.com| 一级爰片在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 日韩av不卡免费在线播放| 三级国产精品片| 日韩精品有码人妻一区| 真实男女啪啪啪动态图| or卡值多少钱| 网址你懂的国产日韩在线| 禁无遮挡网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产91av在线免费观看| 精品午夜福利在线看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 卡戴珊不雅视频在线播放| 九九在线视频观看精品| 中文字幕精品亚洲无线码一区| www日本黄色视频网| 日韩欧美国产在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 天堂√8在线中文| 尾随美女入室| 亚洲五月天丁香| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲成人久久爱视频| 91av网一区二区| 老女人水多毛片| 久久久久久大精品| 国产黄片美女视频| 精品人妻熟女av久视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 99热这里只有是精品50| 深爱激情五月婷婷| 一级黄色大片毛片| 国产人妻一区二区三区在| 日本与韩国留学比较| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲av福利一区| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品久久视频播放| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产一级毛片在线| 亚洲自偷自拍三级| 久久亚洲国产成人精品v| 美女内射精品一级片tv| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 中文字幕亚洲精品专区| 久久精品影院6| 亚洲在久久综合| 春色校园在线视频观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲精品一区蜜桃| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品酒店卫生间| 国产淫片久久久久久久久| 美女大奶头视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 青春草亚洲视频在线观看| 免费av不卡在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久久精品久久久久真实原创| 成人一区二区视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 成人毛片a级毛片在线播放| 特大巨黑吊av在线直播| 99在线人妻在线中文字幕| 色5月婷婷丁香| 天美传媒精品一区二区| 国内精品一区二区在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 美女内射精品一级片tv| 亚洲欧美日韩东京热| 国产男人的电影天堂91| 99热这里只有是精品50| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲av成人精品一区久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美变态另类bdsm刘玥| 高清视频免费观看一区二区 | 亚洲av免费在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 国产成人91sexporn| 国产综合懂色| 国产精品,欧美在线| 欧美97在线视频| 高清av免费在线| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久久久久久黄片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 高清在线视频一区二区三区 | 精品免费久久久久久久清纯| 国产免费男女视频| 精品免费久久久久久久清纯| 精品酒店卫生间| 久久午夜福利片| 天堂中文最新版在线下载 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产淫片久久久久久久久| 日韩精品青青久久久久久| 干丝袜人妻中文字幕| 国产不卡一卡二| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 爱豆传媒免费全集在线观看| 免费人成在线观看视频色| 久久久久久久午夜电影| 在线播放无遮挡| 国产高清有码在线观看视频| av天堂中文字幕网| 午夜精品在线福利| 久久精品人妻少妇| 国产单亲对白刺激| 草草在线视频免费看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲综合精品二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 99热这里只有精品一区| 国产成人免费观看mmmm| 国产淫语在线视频| 亚洲欧洲日产国产| 麻豆一二三区av精品| 激情 狠狠 欧美| 日韩欧美在线乱码| 欧美一区二区亚洲| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 日韩欧美在线乱码| 观看美女的网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 18禁在线播放成人免费| 看免费成人av毛片| 搡老妇女老女人老熟妇| 色5月婷婷丁香| 色播亚洲综合网| 精品国产露脸久久av麻豆 | 久久久久性生活片| 国产精品,欧美在线| 国产91av在线免费观看| 男女国产视频网站| 成年女人看的毛片在线观看| 91精品国产九色| 久久久久久久午夜电影| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 色吧在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 午夜爱爱视频在线播放| 久久久久久伊人网av| 亚洲欧美日韩东京热| 国产中年淑女户外野战色| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产精品女同一区二区软件| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲国产精品久久男人天堂| 一级毛片久久久久久久久女| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 在线播放国产精品三级| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 天堂网av新在线| 一区二区三区免费毛片|