腫瘤表觀遺傳標(biāo)志物的研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀

肖婷 傅俊江

表觀遺傳學(xué)是研究沒(méi)有DNA序列變化的可遺傳的表達(dá)改變。腫瘤癌變進(jìn)程中表觀遺傳學(xué)的變化與遺傳學(xué)的變化大致相同，均能引起抑癌基因失活與原癌基因活化，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵性作用。近年來(lái)，研究者們將腫瘤研究拓展到表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域，在腫瘤惡化過(guò)程中，表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物的變化可能成為腫瘤高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期診斷、治療以及預(yù)后評(píng)估的有效標(biāo)志物。目前表觀遺傳學(xué)的一些關(guān)鍵調(diào)控分子已應(yīng)用于腫瘤臨床診斷，預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)與預(yù)后，并成為臨床上腫瘤靶向治療的靶標(biāo)。表觀遺傳學(xué)分子機(jī)制包括DNA甲基化、非編碼RNA、組蛋白修飾等［1]，本文將從這三個(gè)方面闡述腫瘤表觀遺傳標(biāo)志物的研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀。

1 DNA甲基化

1.1 DNA甲基化的概念

DNA甲基化（DNA methylation）是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基的供體，將一個(gè)甲基基團(tuán)添加到DNA堿基上，最常見(jiàn)的是加在CpG島胞嘧啶的5'位置上。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，DNMTs可分為 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b。DNMT1 的功能是維持已有的DNA原始甲基化狀態(tài)，即催化半甲基化的DNA，并參與修復(fù)DNA的甲基化，而DNMT3a和DNMT3b則是參與催化DNA新的甲基化，即將未甲基化的DNA催化成甲基化的DNA。

腫瘤組織顯著的特征一是癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化；二是DNA啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化增強(qiáng)，而整個(gè)基因組甲基化水平卻較正常細(xì)胞低?；虍惓NA甲基化檢測(cè)正被開(kāi)發(fā)為生物標(biāo)志物［2-3]，用于乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌和肺癌等腫瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估［4]。表1是常見(jiàn)腫瘤中潛在DNA甲基化的蛋白標(biāo)志物［5]，但是不局限于此。譬如，CpG島甲基化表型（CpG island methylation phenotype，CIMP）的概念和 LINE-1（long interspersed nuclear elements 1）家族等也已成為腫瘤診斷、治療和新型抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。

表1 常見(jiàn)的DNA甲基化潛在腫瘤標(biāo)志物

1.2 DNA甲基化作為腫瘤標(biāo)志物

1.2.1 CIMP 根據(jù)癌癥患者DNA啟動(dòng)子區(qū)域廣泛存在甲基化現(xiàn)象，提出了CIMP概念。其中用5個(gè)經(jīng)典的甲基化標(biāo)志物（CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3和SOCS1）區(qū)分結(jié)直腸癌中CIMP程度的高低［6]。盡管CIMP被認(rèn)為是最有潛力的預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物，但其預(yù)測(cè)作用仍有問(wèn)題，難以在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用［7]。目前的研究將CIMP與BRAF、KRAS等其他腫瘤分子生物標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，用于結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)。

1.2.2 LINE-1 LINE-1屬于非長(zhǎng)末端重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄因子家族，散布于整個(gè)基因組DNA中［8]。人體正常組織中大量的LINE-1呈現(xiàn)出被甲基化狀態(tài)，而腫瘤組織中則表現(xiàn)為去甲基化。LINE-1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)有重要作用。研究證明，去甲基化的LINE-1可作為腫瘤檢測(cè)標(biāo)志物［9]。

1.2.3 Septin9 Septin作為一組進(jìn)化保守的GTP結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞周期調(diào)控、極性決定、細(xì)胞分裂等重要細(xì)胞功能。循環(huán)血液中甲基化Septin9可能是結(jié)腸癌的特異性腫瘤標(biāo)志物［10]。美國(guó)FDA于2016年批準(zhǔn)首個(gè)基于腫瘤患者血液的Septin9甲基化篩選檢測(cè)產(chǎn)品。

1.2.4 p16 p16是一個(gè)重要的腫瘤抑制基因，定位于人類染色體9p21。DNA甲基化導(dǎo)致p16失活的頻率甚至高于基因突變導(dǎo)致的失活頻率。研究表明，p16高甲基化與結(jié)直腸癌、肝癌和年輕肺癌患者預(yù)后較差相關(guān)，并已成為人類乳頭狀瘤病毒（HPV）常用的一種代替標(biāo)志物（surrogate marker），具有較高的成本效益［11]。1.2.5 MGMT O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methy lguananine-DNA methy ltrans ferase，MGMT）是一種重要的DNA修復(fù)酶，可去除DNA中O6-鳥(niǎo)嘌呤的突變細(xì)胞毒性化合物，是烷基化劑攻擊的首選位點(diǎn)，能快速修復(fù)烷基化劑對(duì)DNA烷基化的損傷，使細(xì)胞對(duì)烷基化劑產(chǎn)生耐受。正常組織在生理?xiàng)l件下MGMT表達(dá)水平很低，但在烷化劑或輻射作用下MGMT表達(dá)水平升高。2018年NCCN指南明確提出，MGMT是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）重要的預(yù)后和療效預(yù)測(cè)因子。按照MGMT啟動(dòng)子是否存在甲基化可將GBM分成兩類，其中未甲基化類患者對(duì)替莫唑胺（temozolomide，TMZ）耐藥，療效不佳［12-13]。MGMT 甲基化除了可預(yù)測(cè)患者對(duì)化療反應(yīng)外，還可用于預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在沒(méi)有輔助烷基化化療情況下的放療反應(yīng)和預(yù)后。目前，MGMT檢測(cè)試劑盒已研發(fā)，并力求尋找更加靈敏、便捷、微創(chuàng)甚至無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)手段。

1.3 DNA甲基化的抑制劑

DNMT 的抑制劑（DNMT inhibitor，DNMTi）已成為目前表觀遺傳學(xué)抗腫瘤研究的熱點(diǎn)，應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的DNMTi有 5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-d C）、地西他濱、Zebularine和已二酸二辛酯（dioctyladipate，DOA）等，新的 DNMTi也相繼出現(xiàn)在腫瘤基礎(chǔ)研究中，并有望應(yīng)用于臨床腫瘤治療［9，14]。

5-Aza-d C是目前臨床應(yīng)用最廣泛和有效的DNMT，在DNA復(fù)制時(shí)，能代替胞嘧啶與DNMT形成共價(jià)鍵，之后以此抑制DNMT活性。地西他濱是以黃素腺嘌呤二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）為輔酶的DNMTi，可抑制啟動(dòng)子的甲基化。Zebularine是一種胞苷類似物，能完全抑制DNMT1活性，但只能部分抑制DNMT3a和DNMT3b活性。使用5-Aza-C后，再用Zebularine，可有效誘導(dǎo)并穩(wěn)定p16基因的表達(dá)。近年來(lái)，從天然活性產(chǎn)物中提煉和鑒定的DNMTi也得到進(jìn)展，如白藜蘆醇［15]、莪術(shù)醇［16]等，均具有較強(qiáng)的抗卵巢癌能力。

2 非編碼RNA

2.1 非編碼RNA的概念

非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子。但最新研究發(fā)現(xiàn)某些ncRNA也能編碼蛋白質(zhì)。ncRNA一般可分為三類：⑴短于50個(gè)核苷酸的線性非編碼RNA，如微小RNA（miRNA）、piwi相互作用RNA（piRNA）等；⑵長(zhǎng)于200個(gè)核苷酸的線性非編碼RNA，包括核糖體RNA（rRNA）和長(zhǎng)非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）；⑶環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）是另一類結(jié)構(gòu)特殊的非編碼RNA，該類分子呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，無(wú)5'和3'端，因此較線性RNA穩(wěn)定。

2.2 非編碼RNA作為腫瘤標(biāo)志物

根據(jù)對(duì)腫瘤發(fā)生的影響，惡性腫瘤相關(guān)miRNA、lncRNA等可分為促癌基因及抑癌基因。ncRNA通過(guò)影響細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等多種生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮促癌及抑癌功能，且包括miRNA、lncRNA、circRNA等在內(nèi)的多種非編碼RNA在腫瘤組織及癌旁組織中差異性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)及鑒定腫瘤相關(guān)非編碼RNA標(biāo)志物對(duì)腫瘤診斷及精準(zhǔn)治療將產(chǎn)生劃時(shí)代意義。

在眾多的ncRNA中，miR-34a是研究較早和較為成熟的miRNA，其表達(dá)由p53基因調(diào)控，通過(guò)結(jié)合到眾多的靶基因3'-UTR上而抑制靶基因的表達(dá)或降解靶基因mRNA，從而發(fā)揮抑癌功能。研究表明，lncRNA、mRNA和circRNA均能作為競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），以此中和 miR-34a的抑癌功能［17-18]。miR-34a不僅可作為診斷和預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物，也有望作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。相關(guān)的小鼠動(dòng)物模型和納米載體藥物傳遞研究正在進(jìn)行。2013年4月，一種填充miR-34a模擬物的特殊脂質(zhì)納米粒子MRX34，作為第一個(gè)ncRNA治療藥物用于腫瘤患者臨床Ⅰ期試驗(yàn)（NCT01829971，https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01829971）。2016年8月，MRX34又進(jìn)行了晚期黑色素瘤患者臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)（NCT02862145，https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02862145）。雖然由于嚴(yán)重副作用而停止了臨床試驗(yàn)，但它開(kāi)創(chuàng)了ncRNA臨床治療的先河［18]。本團(tuán)隊(duì)初步研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，miR-34a與百里醌能產(chǎn)生協(xié)同作用，其聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力［19]。

lncRNA基于其獨(dú)特的組織特異性和腫瘤特異性表達(dá)模式，有望成為腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的有效生物標(biāo)志物。但迄今為止，尿PCA3是唯一被轉(zhuǎn)化為經(jīng)FDA批準(zhǔn)的用于分子腫瘤診斷試驗(yàn)的非編碼RNA（PRO-GENSA PCA3）。lncRNA不僅有可能作為標(biāo)志物用于腫瘤的診斷，也可能作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，但真正應(yīng)用于治療，依然任重道遠(yuǎn)。

3 組蛋白修飾

3.1 組蛋白修飾的概念

每個(gè)核小體由146 bp的DNA纏繞核心組蛋白八聚體（2個(gè)拷貝的 H2A、H2B、H3、H4）1.75圈形成。組蛋白氨基末端（N端）結(jié)構(gòu)域伸出核小體，可同其他調(diào)節(jié)蛋白和DNA發(fā)生相互作用。組蛋白修飾有甲基化、乙酰化、泛素化、巴豆酰化和磷酸化等。異常的組蛋白修飾失衡可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，為腫瘤的診斷、預(yù)后評(píng)估和靶向治療提供新的思路［20]。

3.2 組蛋白甲基化修飾作為腫瘤標(biāo)志物

組蛋白甲基化（histone methylation）是指發(fā)生在H3和H4組蛋白氨基端精氨酸或賴氨酸殘基上的甲基化。組蛋白甲基化由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMT）催化；而組蛋白去甲基化酶，大致分為賴氨酸特異性脫甲基酶（lysine-specific demethylase，LSD）家族和JmjC結(jié)構(gòu)域家族（jmjC domain-containing family，JMJD）。調(diào)節(jié)組蛋白甲基化酶會(huì)導(dǎo)致組蛋白甲基化水平升高或降低，進(jìn)一步引發(fā)腫瘤。目前調(diào)節(jié)組蛋白修飾酶的藥物如EZH2抑制劑（EZH2 small molecule inhibitor，EZH2i）［21-22]等已處于臨床試驗(yàn)階段。

3.3 EZH2

組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）編碼一個(gè)含SET結(jié)構(gòu)域的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。多梳抑制復(fù)合物2（ploycomb repressive complex 2，PRC2）蛋白復(fù)合物催化SET結(jié)構(gòu)域的EZH2，使組蛋白H3第27位的賴氨酸發(fā)生三甲基化（H3K27me3），從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制。EZH2能使多種腫瘤發(fā)生增殖與轉(zhuǎn)移，包括黑色素瘤［23]、口腔鱗狀細(xì)胞癌和乳腺癌［24]等。H3K27的去甲基酶在細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度H3K27me3修飾后，喪失了動(dòng)態(tài)平衡，使用EZH2i可讓細(xì)胞恢復(fù)平衡狀態(tài)［25]。研究發(fā)現(xiàn)EZH2i能抑制EZH2的活性，降低細(xì)胞內(nèi)H3K27me3，有效抑制EZH2突變的淋巴瘤細(xì)胞系的增殖［26]。

EZH2i包括 3-deazaneplanocin A（DZNep）、GSK926、GSK-343、E PZ-005687、EPZ-011989、UNC-1999 和 CPI-169等，已通過(guò)臨床前試驗(yàn)。DZNep結(jié)合S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosyl-L-homocysteine，SAH）水解酶抑制劑可抑制腦瘤和前列腺癌細(xì)胞的血管生成和侵襲［27]，并降低膽管癌干細(xì)胞的存活率［28-29]。GSK926能抑制乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞中EZH2的活性，從而降低H3K27me3水平［30]。EPZ-005687和 EPZ-011989通過(guò)降低H3K27me3，并以雜合突變型EZH2（Tyr 641和Ala 677）［31]殺死淋巴瘤細(xì)胞，抑制B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。而UNC-1999能同時(shí)抑制EZH1和EZH2的活性［32]。CPI-169通過(guò)降低H3K27me3抑制EZH2活性，從而抑制彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)展［33]。上述EZH2i已進(jìn)行了細(xì)胞或動(dòng)物的臨床前研究，但仍需在臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步評(píng)估。

Tazemetostat（EPZ-6438，E7438）［34]、CPI-1205、GSK2816126等小分子的S-腺苷-甲硫氨酸（SAM）競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，對(duì)EZH2具有有效的選擇性作用。目前這3種小分子正在不同腫瘤中進(jìn)行臨床試驗(yàn)，臨床試驗(yàn)的詳細(xì)情況可以從臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//clinicaltrials.gov）中獲得。

3.4 組蛋白乙?；揎椬鳛槟[瘤標(biāo)志物

組蛋白乙酰化（histone acetylation）是一個(gè)可逆的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。組蛋白乙?；腿ヒ阴；g的動(dòng)態(tài)平衡是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一個(gè)非常重要因素，可維持基因表達(dá)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，如打亂這種動(dòng)態(tài)平衡則導(dǎo)致基因異常表達(dá)，最終可引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這種動(dòng)態(tài)平衡本質(zhì)上是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）調(diào)節(jié)。HDAC包括多個(gè)家族成員（classⅠ、Ⅱa、Ⅱb和Ⅳ），是目前研究最熱的抗癌靶點(diǎn)之一。組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACi）通過(guò)抑制 HDAC 活性，促進(jìn)組蛋白乙?；梢种瓢┘?xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化及凋亡?；贖DACi的重要性，在此重點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行如下綜述。

HDACi通過(guò)抑制組蛋白去乙?；?，使染色質(zhì)構(gòu)型松散，解除低乙?；瘜?duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，可使異常沉默的基因重新表達(dá)，達(dá)到治療腫瘤的目的。HDACi高效低毒的優(yōu)點(diǎn)，使其在腫瘤臨床應(yīng)用研究中炙手可熱。迄今美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于癌癥臨床試驗(yàn)的HDACi有 4 種，即 Volinostat、Romidepsin、Belinostat和Panobinostat，此外其他HDACi也正在接受各種癌癥患者的臨床試驗(yàn)［35]。

Volinostat是一種以羥肟酸為基礎(chǔ)的藥物，也稱為亞硝胺羥肟酸（SAHA）。Zolinza是FDA批準(zhǔn)的第一種用于皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）的Volinostat。據(jù)報(bào)道，Volinostat也適用于其他類型的腫瘤，如腦轉(zhuǎn)移、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌和多發(fā)性骨髓瘤［36]。Volinostat和替莫唑胺聯(lián)合放療的臨床試驗(yàn)用于多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的早期治療（NCT 00731731）。

Romidepsin是FDA批準(zhǔn)的第2種治療CTCL的藥物，但有惡心、嘔吐、心臟毒性和骨髓毒性等不良反應(yīng)［37-38]。在30項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，Romidepsin作為單一藥物（NCT 00426764）或與其他藥物（NCT 03141203）聯(lián)合用于治療復(fù)發(fā)或難治性外周T細(xì)胞淋巴瘤（PTCL）［36]，但其副作用仍不可忽視。

Belinostat是2014年被FDA批準(zhǔn)用于PTCL治療的第3種HDACi藥物。它是一種能抑制Ⅰ類和Ⅱ類HDACs活性的羥基酸鹽。120例PTCL患者臨床試驗(yàn)研究（NCT 00865969）ORR 為26%［36]。Belinostat目前正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)超過(guò)15個(gè)，包括用于治療CTCL（NCT00274651）、多發(fā)性骨髓瘤（NCT00431340）、Burkitt淋巴瘤（NCT 00303953）、輸卵管癌中的實(shí)體瘤（NCT 00301756）［39]等。

Panobinostat于2015年被FDA批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)治療多發(fā)性骨髓瘤［38]。它是一種羥基化衍生物，對(duì)Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類HDACs具有抑制作用。腹瀉和心臟毒性是其副作用。Panobinostat已用于治療其他類型的腫瘤，如 CTCL（NCT 00490776）、AML（NCT 01613976）、Hodgkin 淋巴瘤（NCT00742027）、MDS（NCT00594230）、甲狀腺癌（NCT 01013597）、結(jié)直腸癌和前列腺癌（NCT 00663832）等 50 多個(gè)臨床試驗(yàn)中［39]。

4 小結(jié)

表觀遺傳學(xué)中的DNA甲基化、非編碼RNA、組蛋白修飾與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這將有助于研究者對(duì)表觀遺傳學(xué)分子機(jī)制的進(jìn)一步探索，并指導(dǎo)腫瘤的診斷、治療、預(yù)后以及新藥的研發(fā)，為腫瘤患者帶來(lái)新的希望。目前認(rèn)為DNMTi和HDACi聯(lián)合應(yīng)用可降低單獨(dú)使用該類藥物的相關(guān)副作用。HDACi因其效率高、毒性小的特點(diǎn)，已有部分藥物應(yīng)用于臨床治療，其他藥物仍處于臨床試驗(yàn)階段。EZH2既是原癌基因，又是抑癌基因，基于其雙重特點(diǎn)，應(yīng)嚴(yán)格把握EZH2i的適應(yīng)證和劑量，以達(dá)到最佳治療效果。總之，腫瘤表觀遺傳學(xué)改變是可逆的過(guò)程，相信腫瘤表觀遺傳標(biāo)志物定會(huì)成為腫瘤標(biāo)志物領(lǐng)域的一個(gè)新方向，以及腫瘤診斷、治療和預(yù)后的新靶點(diǎn)，為腫瘤治療提供新的契機(jī)。