意大利牛舌草提取物抗炎鎮(zhèn)咳與體外抑菌作用*

徐曉琴，陳良，張娟，孫宇，卿德剛，倪慧

(1.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830000)

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)又名牛舌草[1]“高孜萬”[2]，源于紫草科牛舌草屬植物，主要分布于地中海和熱帶地區(qū)[3]，為維吾爾醫(yī)臨床常用藥，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》維藥分冊中，全草入藥，具有生濕生熱、潤燥消炎、止咳平喘等功效，廣泛用于心血管疾病與呼吸系統(tǒng)疾病的治療，如肺炎、高血壓、結(jié)核病、寒性咳嗽、感冒等[4]，是維吾爾醫(yī)經(jīng)典復(fù)方不可缺少的主藥之一[5]。意大利牛舌草含有揮發(fā)油、黃酮類、三萜類、酚類和生物堿類等多種成分[6]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實其具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用、內(nèi)分泌作用以及保護心血管等藥理活性[5]，但是，在抗炎、鎮(zhèn)咳、體外抑菌等方面的研究較少，本課題組基于意大利牛舌草的臨床應(yīng)用，對不同提取物展開活性評價，篩選其有效部位，為闡明意大利牛舌草抗炎、鎮(zhèn)咳的藥理作用及發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠，無特定病原體(SPF)級，體質(zhì)量150～180 g，110只，雄性；昆明種小鼠，SPF級，18～22 g，100只，雌雄各半，購自新疆實驗動物研究中心。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(新)2016-0007。在溫度為20～24 ℃、相對濕度為40%～60%、12 h光照交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.2儀器 Mettler Toledo AB265-S電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg)；UPT-I-5T優(yōu)普超純水儀(成都純化科技有限公司)；YLS-8A多功能誘咳引喘儀(濟南益延科技有限公司)；BSC-1300II A/ B3生物安全柜(上海博訊實業(yè)有限公司)；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司)；KXQ.SG46.280高壓滅菌鍋(上海佳騰實驗設(shè)備有限公司)；JM300/0.1電子天平(余姚紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司，感量：0.1 mg)。

1.3材料 意大利牛舌草(批號：15120405，新疆奇康哈博中維藥飲片有限公司，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)李永和教授鑒定，符合維吾爾藥地方標(biāo)準(zhǔn)要求)；意大利牛舌草提取物(實驗室自制，含蘆丁0.52%)；角叉菜膠(Sigma公司，25 g，批號：SLBR0530V)；醋酸地塞米松片(天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司，批號：141014，規(guī)格：每片0.75 mg)；急支糖漿(太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，規(guī)格：200 mL)；左氧氟沙星(武漢精細化工，批號：1502102)；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(青島日水生物有限責(zé)任公司，批號：20150204)；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(青島日水生物有限責(zé)任公司，批號：20160601)；二甲亞砜(SIGMA-VETEC公司，批號：WXDB2507V)。

菌株：大腸埃希菌(ATCC25922)；銅綠假單胞菌(ATCC27853)；金黃色葡萄球菌(ATCC25923)；白念珠菌[CMCC(F)98001]；枯草芽孢桿菌(CMCC63501)，以上菌株購自新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗所。

1.4意大利牛舌草提取物的制備 取干燥的意大利牛舌草8.0 kg，粉碎成粗粉，以25倍量體積分數(shù)為70%乙醇溶液加熱回流提取1.5 h，提取2次，濾過，收集合并提取液，低溫濃縮至完全無醇味，取適量濃縮干燥得到乙醇粗提物(提取率17.37%)；剩余藥液分批取適量，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇溶劑萃取(其提取率分別為0.50%，0.48%，0.74%，3.88%)，收集各部位萃取液及水溶液減壓回收溶劑，干燥得到不同萃取部位浸膏，其中乙酸乙酯、正丁醇、水溶物中蘆丁含量分別為0.32%，1.57%，0.17%。

1.5不同提取物抗炎實驗 采用大鼠足趾腫脹急性炎癥模型[7-8]，將SD大鼠按照隨機數(shù)字表分為11組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組、地塞米松組(醋酸地塞米松5 mg·kg-1)，以及乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水溶物的大、小劑量組(按生藥量計為2.52，0.63 g·kg-1)，按10 mL·kg-1容積每日灌胃1次，空白對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h后用千分尺測定每只大鼠右后足趾厚度，然后在右后腳跖皮下注射1%角叉菜膠溶液0.1 mL，空白對照組注射等容積0.9%氯化鈉溶液，分別于注射后0.5，1，2，4，6 h測量大鼠右后足趾厚度，按下式計算足趾腫脹度(mm)。

腫脹度(mm)=致炎后足趾厚度-致炎前足趾厚度。

1.6不同提取物鎮(zhèn)咳實驗 取咳嗽敏感小鼠按照隨機數(shù)字表分成10組[9-10]，每組10只，分別為空白對照組(0.9%氯化鈉溶液，30 mL·kg-1)，急支糖漿組(急支糖漿，13 g·kg-1)，以及乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水溶物大、小劑量組(按生藥量計為3.04，0.90 g·kg-1)，每天灌胃給藥1次，連續(xù)5 d，灌胃體積均為0.2 mL·(10 g)-1，第5天給藥1 h后，將小鼠逐一放入誘咳引喘儀的密閉干燥籠具內(nèi)，恒壓噴入體積分數(shù)為25%濃氨水氣霧，噴霧4 s引咳，觀察記錄咳嗽潛伏期及2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，比較不同提取物的鎮(zhèn)咳作用?？人詷?biāo)準(zhǔn)：腹肌收縮，同時張大嘴，有時有咳聲，若潛伏期<1 min，且在1 min內(nèi)出現(xiàn)3次以上典型咳嗽者為敏感動物，否則淘汰。

1.7不同提取物體外抑菌實驗

1.7.1菌懸液的配置 取檢測菌凍存液，37 ℃復(fù)蘇，取凍存液10 μL加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5 mL中，37 ℃搖床擴大培養(yǎng)12 h，經(jīng)平板分離后用無菌接種環(huán)挑選單菌落，加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基50 mL，培養(yǎng)16 h，麥?zhǔn)媳葷岱ù_定菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)液。

1.7.2藥物配置 稱取4種提取物干粉各2.56 g，分別溶于營養(yǎng)肉湯10 mL中，乙酸乙酯提取物溶于含4%二甲亞砜的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10 mL中，攪拌混勻，115 ℃，30 min滅菌。按兩倍梯度稀釋后并按1：1與含菌液培養(yǎng)基混合，配置左氧氟沙星濃度為128，64，32，16，8，4，2，1和0.5 mg·mL-1的溶液。

1.7.3左氧氟沙星(陽性藥)配置 按兩倍梯度稀釋法，配置左氧氟沙星濃度為128，64，32，16，8，4，2，1和0.5 μg·mL-1的溶液。

1.7.4體外抑菌實驗 采用試管稀釋法，取配制好的濃度藥液加入試管每管3 mL，每管加待測菌液3 mL，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。結(jié)果判定以肉眼觀察，以試管中無細菌生長者藥物最低濃度為該實驗菌最小抑菌濃度(MIC)，如藥物高濃度組顏色較深無法觀測時，取藥物前3個稀釋度做涂布觀測；吸取未長菌試管培養(yǎng)液，每皿100 μL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察菌的生長情況，無菌生長平板所含的最低藥物濃度即為最低殺菌濃度值(MBC)。

2 結(jié)果

2.1抗炎實驗結(jié)果 與空白對照組比較，模型對照組大鼠足趾腫脹度顯著增加(P<0.01)；與模型對照組比較，0.63，2.52 g·kg-1意大利牛舌草乙醇提取物組在致炎后2 h內(nèi)各時間段抑制大鼠足趾腫脹程度顯著(P<0.01)；2.52 g·kg-1乙酸乙酯與正丁醇組在致炎后的4 h各時間段內(nèi)抑制大鼠足趾腫脹程度顯著(P<0.01)，見表1。

2.2鎮(zhèn)咳實驗結(jié)果 在延長咳嗽潛伏期方面，與模型對照組比較，急支糖漿組、乙酸乙酯大劑量組，正丁醇大、小劑量組實驗小鼠的咳嗽潛伏期均延長(P<0.05)；乙醇提取物大、小劑量組及正丁醇大劑量組的延長潛伏期作用與急支糖漿組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；在減少咳嗽次數(shù)方面，急支糖漿組，乙醇提取物大劑量組，乙酸乙酯及正丁醇大、小劑量組，水溶物大劑量組實驗小鼠的咳嗽次數(shù)均減少，其中乙酸乙酯大劑量組與正丁醇大劑量組咳嗽次數(shù)較急支糖漿組明顯減少(P<0.01)，見表2。

2.3體外抑菌實驗結(jié)果 由平板計數(shù)驗證的菌落數(shù)均在范圍內(nèi)，則工作液濃度約為106cfu·mL-1，符合營養(yǎng)肉湯稀釋法前提條件，見表3。意大利牛舌草4種不同提取物對5種菌株的抑制能力不同。見表4。

表1 不同極性提取物對大鼠足趾腫脹度的影響

組別劑量/(g·kg-1)足趾腫脹度0.5 h1 h2 h4 h6 h空白對照組—1.68±0.38?11.26±0.6?11.01±0.30?1?20.32±0.32?10.09±0.17?1模型對照組—2.55±0.25?32.40±0.34?32.37±0.31?31.35±0.27?30.47±0.29?2地塞米松組51.27±0.41?11.52±0.41?11.30±0.12?10.46±0.20?10.12±0.22?4乙醇 小劑量組0.631.57±0.59?11.89±0.71?41.91±0.42?4?31.05±0.64?30.46±0.59?2 大劑量組2.521.36±0.32?11.76±0.40?11.68±0.56?10.86±0.53?4?20.32±0.34乙酸乙酯 小劑量組0.632.14±0.40?31.95±0.61?4?21.91±0.64?4?31.22±0.55?30.31±0.28 大劑量組2.521.80±0.79?1?21.53±0.13?11.68±0.42?10.94±0.60?1?20.18±0.20?4正丁醇 小劑量組0.631.96±0.64?1?32.15±0.57?32.03±0.71?31.14±0.46?30.18±0.24?4 大劑量組2.521.68±0.43?11.74±0.27?11.68±0.25?1?20.95±0.31?1?20.14±0.19?4水溶物 小劑量組0.631.70±0.33?12.10±0.44?32.13±0.27?31.50±0.51?30.52±0.34?3 大劑量組2.521.85±0.54?1?32.07±0.35?21.98±0.41?4?31.24±0.43?1?20.24±0.21

與模型對照組同一時間點比較，*1P<0.01，*4P<0.05；與地塞米松組同一時間點比較，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with model control group at the same time point,*1P<0.01，*4P<0.05; Compared with dexamethasone group at the same time point,*2P<0.05,*3P<0.01

表2 各組小鼠對濃氨水致咳嗽反應(yīng)

組別劑量/(g·kg-1)咳嗽潛伏期/s2 min咳嗽次數(shù)模型對照組-30.87±6.44?145.35±10.04?1急支糖漿組1340.47±2.29?236.77±9.60?2乙醇 小劑量組0.9027.33±7.49?337.15±8.92 大劑量組3.0429.83±3.61?137.03±9.35?2乙酸乙酯 小劑量組0.9032.97±12.9430.87±6.67?4 大劑量組3.0441.74±9.15?221.93±5.46?3?4正丁醇 小劑量組0.9041.42±14.23?232.37±10.15?4 大劑量組3.0451.95±12.62?1?424.22±7.02?3?4水溶物 小劑量組0.9032.90±11.4839.00±10.43 大劑量組3.0439.47±10.5336.4±6.69?2

與急支糖漿組比較，*1P<0.05，*3P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*4P<0.01

Compared withjizhisyrup group,*1P<0.05，*3P<0.01; Compared with model control group,*2P<0.05，*4P<0.01

3 討論

本實驗采用經(jīng)典的角叉菜膠致大鼠足趾腫脹模型評價意大利牛舌草各提取部位的抗炎藥理活性。在模型建立過程中，模型對照組大鼠足趾腫脹度較空白對照組顯著增加，表明大鼠足趾腫脹模型造模成功，致炎后大鼠足趾發(fā)生炎癥，腫脹度隨時間發(fā)生相應(yīng)的變化。致炎0.5 h后，空白對照組與模型對照組腫脹度值達到高峰，0.5～2 h內(nèi)，腫脹度值變化較小，而在4 h后兩組的腫脹度值均開始回落，空白對照組在6 h后腫脹逐漸恢復(fù)正常，模型對照組值在6 h后回落明顯，考慮與角叉菜膠所致機體的急性炎癥反應(yīng)有關(guān)，此結(jié)果與國內(nèi)相關(guān)報道接近[12]。

本研究顯示，意大利牛舌草乙醇提取部位(0.63，2.52 g·kg-1)在致炎后2 h抑制大鼠足趾腫脹程度顯著(P<0.01)，2.52 g·kg-1劑量組在致炎4 h內(nèi)抑制炎癥作用與醋酸地塞米松組作用相當(dāng)，正丁醇部位與乙醇部位的抑制炎癥效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示乙醇粗提取部位及正丁醇部位具有抗炎活性；小鼠鎮(zhèn)咳實驗反應(yīng)，乙醇提取物組(3.04，0.90 g·kg-1)與正丁醇部位組(3.04 g·kg-1)延長小鼠咳嗽潛伏期作用與急支糖漿組作用相當(dāng)(P<0.05或P<0.01)，并且乙醇提取部位、正丁醇部位3.04 g·kg-1劑量組咳嗽次數(shù)明顯減少(P<0.05)，此結(jié)果提示意大利牛舌草乙醇提取部位、正丁醇部位均具有鎮(zhèn)咳作用；二倍試管稀釋法篩選不同提取物的抑菌活性實驗顯示，4種意大利牛舌草提取物分別對枯草芽孢桿菌具有抑菌活性，其中乙酸乙酯部位與水溶部位的抑制水平較其他部位明顯。

表3 菌液稀釋液濃度驗證結(jié)果

表4 牛舌草提取物對5種菌株MIC和MBC結(jié)果

Tab.4MICandMBCofextractsofAnchusaitalicaRetz.onfivestrainsmg·mL-1

組別大腸埃希菌MICMBC金黃色葡萄球菌MICMBC枯草芽孢桿菌MICMBC銅綠假單胞菌MICMBC白念珠菌MICMBC左氧氟沙星組0.5×10-30.5×10-30.5×10-30.5×10-30.5×10-31×10-31×10-34×10-30.5×10-32×10-3乙醇提取物組>128>12864>12832128>128>128>128>128乙酸乙酯提取物組>128>128>128>12843264>128>128>128正丁醇提取物組>128>128>128>128>128>128>128>12864>128水溶物組>128>128>128>12846464>128128>128

本研究表明，意大利牛舌草乙醇粗提物具有抗炎、鎮(zhèn)咳的藥理活性，其正丁醇部位的活性較其他部位明顯，并且與乙醇粗提取物的作用相當(dāng)，在有效物質(zhì)提取富集方面，正丁醇部位的提取率均高于其他極性部位，提示意大利牛舌草提取物在抗炎、鎮(zhèn)咳方面顯現(xiàn)出藥理活性，值得深入研究。