毛序棘豆生物堿成分分析

孫 暾 ,周 樂(lè) ,王建國(guó) ,尤延飛 ,趙世姣 ,趙寶玉

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌712100 ;2.新疆喀什地區(qū)草原站,新疆喀什 844000)

毛序棘豆(Oxytropis trichophora)為豆科(Leguminosae)棘豆屬(Oxytropis)植物,具有枯竭晚,返青早,易充分利用土地的養(yǎng)分、水分和光照資源,抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)[1],廣泛分布于我國(guó)河北、山西、陜西及甘肅等省區(qū)[2],在天然草地退化嚴(yán)重的地方能發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)種群。近年來(lái)研究人員已從該屬植物中分離鑒定出140 余種化合物,以生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)為主;此外,還有少量的木脂素、甾體等化合物。大量研究表明,共生于棘豆屬植物中的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物堿對(duì)牲畜有毒副作用[3-4]。多年的臨床實(shí)踐表明,棘豆屬植物藥理活性顯著,尤其廣泛用于藏醫(yī)和蒙醫(yī)臨床[5]。

近年來(lái),由于人為和氣候變化等原因,天然草地退化嚴(yán)重,毒草滋生蔓延,牧草資源日益匱乏。遏制毒害草蔓延,開(kāi)發(fā)新的草業(yè)資源對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展和生態(tài)保護(hù)具有深遠(yuǎn)意義。雖然毛序棘豆同屬棘豆屬植物,但國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究主要集中在植物學(xué)特性方面,關(guān)于化學(xué)成分的研究尚未見(jiàn)報(bào)道,所含營(yíng)養(yǎng)成分狀況及其藥用活性、毒性尚不明確。本文以采自甘肅省定西市通渭縣的毛序棘豆為研究對(duì)象,對(duì)毛序棘豆進(jìn)行生物堿成分分析,鑒定其所含生物堿種類(lèi),從而為后續(xù)毒理學(xué)研究及其開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物樣品 毛序棘豆新鮮植株2016 年8 月采自甘肅省定西市通渭縣(34°55′N(xiāo),104°57′E),晾干,粉碎后置陰涼處保存?zhèn)溆?。植物樣品由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院常朝陽(yáng)研究員鑒定。

1.2 主要儀器與試劑 HP6890/5975C GC-MS 聯(lián)用儀,美國(guó)安捷倫公司;MC 浙制02810218XMTB 數(shù)顯控溫水浴鍋,北京市長(zhǎng)風(fēng)儀表公司;RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;Canoscan LiDE 30彩色圖像掃描儀,佳能公司;UV-III 三用紫外分析儀,北京炳洋科技有限公司; SHB-III 循環(huán)式多用真空泵,鄭州長(zhǎng)城科貿(mào)有限公司。硅膠GF254,青島海洋化工廠;改良碘化鉍鉀顯色劑現(xiàn)用現(xiàn)配;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 毛序棘豆生物堿的提取 采用工業(yè)酒精熱回流法提取。取毛序棘豆干粉200 g,裝入2 000 mL圓底燒瓶中加適量工業(yè)酒精于60 ℃條件下熱回流提取,每次熱回流4 h,連續(xù)進(jìn)行直至提取液澄清無(wú)色為止。提取完畢后將各批次提取液分別減壓回收,將所得浸膏合并后計(jì)算出膏率。根據(jù)生物堿的溶解性和極性依次采用酸性氯仿、堿性氯仿和堿性正丁醇對(duì)工業(yè)酒精提取部分進(jìn)行分段萃取。每次萃取完后,減壓回收溶劑得各部分浸膏,計(jì)算出各萃取段出膏率。所得堿性氯仿和堿性正丁醇萃取物即為毛序棘豆總生物堿。

1.4 薄層色譜分析 使用自制薄層板取上述各浸膏無(wú)水乙醇溶解液,用毛細(xì)管吸取適量液體,點(diǎn)于距薄層板底邊約0.5 cm 的起始線上,點(diǎn)與點(diǎn)之間距離保持在0.5～1 cm,樣點(diǎn)直徑小于2 mm,各樣點(diǎn)位于同一水平位置。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)后選取適宜展開(kāi)劑,放入展開(kāi)槽中上行法展開(kāi),展開(kāi)前沿距玻璃板上端1 cm時(shí)取出用電吹風(fēng)機(jī)吹干,使用改良碘化鉍鉀顯色。

1.5 硅膠柱層析法除雜純化 將各萃取段按質(zhì)量比1∶1與柱層析硅膠充分拌勻,用氯仿濕法裝柱,干法上樣,后依次使用氯仿、氯仿∶乙醇(10∶1)、氯仿∶乙醇(5∶1)、氯仿∶乙醇(3∶1)、氯仿∶乙醇(1∶1)、乙醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫,樣品使用薄層色譜法檢測(cè),并合Rf值相同或相近的組份。

1.6 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析 將純化后的樣品用甲醇溶解,用GC-MS 儀器檢測(cè)生物堿的種類(lèi)和相對(duì)含量。氣相色譜條件:色譜柱為Agilent 19091S-433 HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane 毛細(xì)管柱,柱溫50 ℃(保留2 min),以5 ℃/min 升溫至325 ℃,保持10 min;運(yùn)行時(shí)間:64 min;汽化室溫度250 ℃; 載氣為高純 He (99.999%); 柱前壓7.65 psi,載氣流量1.0 mL/min,不分流,溶劑延遲時(shí)間:3.0 min。質(zhì)譜條件:離子源為EI 源;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;發(fā)射電流34.6 μA;倍增器電壓1294 V;接口溫度280 ℃;質(zhì)量范圍29～500 amu。

2 結(jié)果

2.1 毛序棘豆生物堿成分分析

2.1.1 生物堿提取及薄層色譜分析結(jié)果 使用工業(yè)酒精熱回流法提取的浸膏含量為20.41 g,出膏率為10.21%。其中工業(yè)酒精熱回流法提取酸性氯仿段浸膏重量為0.49 g,出膏率為2.40%;堿性氯仿段浸膏重量為0.01 g,出膏率為0.05%;堿性正丁醇段浸膏重量為1.01 g,出膏率為4.90%。

毛序棘豆工業(yè)酒精提取部分堿性氯仿萃取段,共使用了10 種展開(kāi)系統(tǒng)進(jìn)行展開(kāi),其中V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(氨水)=10∶1∶1展開(kāi)效果最好,在改良碘化鉍鉀顯色條件下有4 個(gè)斑點(diǎn);堿性正丁醇萃取段,共使用了7 種展開(kāi)系統(tǒng)進(jìn)行展開(kāi),其中V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1展開(kāi)效果最好,在改良碘化鉍鉀顯色條件下有2 個(gè)斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 毛序棘豆生物堿薄層色譜分析結(jié)果

2.1.2 毛序棘豆生物堿GC-MS 分析結(jié)果 堿性氯仿經(jīng)柱層析除雜后合并為1 份待測(cè)樣品;堿性正丁醇段共回收56 瓶樣品,經(jīng)薄層色譜法分析合并為2瓶待測(cè)樣品,命名為堿性正丁醇1(4-21 組分)和堿性正丁醇2(22-56 組分)。

將上述3 份樣品進(jìn)行GC-MS 分析鑒定,堿性氯仿部分共出峰11 個(gè),經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist2008 和Wiley275 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖,檢出5 種化合物,含3 種生物堿,分別是鷹爪豆堿、二苯胍、臭豆堿(圖1、表2);堿性正丁醇1 共出峰14 個(gè);堿性正丁醇2 共出峰17 個(gè),合并相同結(jié)果后共鑒定出17種化合物(圖2 和圖3);含2 種生物堿,為腺嘌呤、2-(1-吡咯烷基)-2-環(huán)戊烯-1-酮(表3)。

3 討論

3.1 生物堿成分 生物堿為含氮堿性有機(jī)化合物,通常具有復(fù)雜的含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu),有光學(xué)活性和顯著的生理作用,往往是植物中的重要活性成分和毒性成分,有廣泛的藥用價(jià)值。我國(guó)學(xué)者曹光榮(1989)首次在黃花棘豆、甘肅棘豆中分離出苦馬豆素[6]。葛鵬斌等陸續(xù)在小花棘豆、冰川棘豆、寬苞棘豆中分離出苦馬豆素[7-9]。于榮敏等由小花棘豆、黃花棘豆中分離出多種喹諾里西啶生物堿,包括臭豆堿、野決明堿、N-甲?；鹑富▔A和鷹爪豆堿[10]。目前,研究人員已從棘豆屬植物中分離鑒定出33 種生物堿,其中喹喏里西啶類(lèi)8 種,吲哚里西啶類(lèi)3 種,哌啶類(lèi)1 種,喹啉類(lèi)1 種,有機(jī)酰胺類(lèi)15 種,其他類(lèi)化合物5 種。近年研究表明,棘豆屬植物中的喹喏里西啶生物堿和吲哚里西啶生物堿成分是該屬植物毒性的主要成分,此外這兩類(lèi)生物堿有顯著的抗腫瘤等生理活性。其中苦馬豆素是目前抗腫瘤藥物研究的一大熱點(diǎn)。

表2 堿性氯仿GC-MS 檢測(cè)結(jié)果

圖1 毛序棘豆堿性氯仿GC-MS 總離子流圖

圖2 毛序棘豆堿性正丁醇1 GC-MS 總離子流圖

圖3 毛序棘豆堿性正丁醇2 GC-MS 總離子流圖

表3 堿性正丁醇GC-MS檢測(cè)結(jié)果

毛序棘豆生物堿主要集中在堿性二氯甲烷萃取段。GC-MS 檢測(cè)從堿性二氯甲烷和堿性正丁醇段鑒定出鷹爪豆堿、臭豆堿、二苯胍、腺嘌呤、2-(1-吡咯烷基)-2-環(huán)戊烯-1-酮共5 種生物堿,其中臭豆堿相對(duì)含量最高,為4.49%;其次為鷹爪豆堿,含量為4.12%。研究表明,臭豆堿是棘豆屬植物中主要有毒生物堿,能致家畜畸形,使胎兒流產(chǎn)、腭裂腿和脊柱變形,對(duì)較高等的動(dòng)物有致畸作用[11],能抑制血清型為HBeAg 的乙型肝炎病毒,具有抗病毒活性。鷹爪豆堿具有顯著的抗心律失常作用,能降低心肌的應(yīng)激性和傳導(dǎo)性,減慢心率,抑制心臟收縮力,曾用作抗心律失常藥以治療室性心動(dòng)過(guò)速和功能性心悸[12]。臭豆堿及鷹爪豆堿均能阻斷神經(jīng)節(jié),后者還能降低腎上腺皮質(zhì)及頸動(dòng)脈竇的反應(yīng)性,這類(lèi)化合物還具有興奮中樞、抗腫瘤和殺蟲(chóng)等活性[12]。二苯胍為工業(yè)橡膠生產(chǎn)中常用的加工劑,有一定毒性。腺嘌呤是核酸的組成成分,參與遺傳物質(zhì)的合成。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,毛序棘豆含有多種有毒生物堿成分,但還需通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)以確定毒性作用。本試驗(yàn)中通過(guò)苦馬豆素三步顯色法未能在提取物中檢測(cè)出苦馬豆素,由于苦馬豆素極性較大,不易氣化,通過(guò)GC-MS 檢測(cè)并不能確定本批次樣品中是否含有苦馬豆素,因此毛序棘豆是否能歸為瘋草類(lèi)有毒植物還需進(jìn)一步研究。上述生物堿均為首次從毛序棘豆中鑒定出,豐富了棘豆屬植物的研究?jī)?nèi)容。為毛序棘豆的毒性評(píng)價(jià)及開(kāi)發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。