c-di-AMP
——細(xì)菌中第二信使的研究進(jìn)展

金 華， 馬春驥， 韓 楊， 羅海霞， 李 敏* ， 郝秀靜*

(1.寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 寧夏 銀川 750021)

環(huán)二腺苷酸(cyclic diadenylate monophosphate，c-di-AMP)是在細(xì)菌中新發(fā)現(xiàn)的廣泛存在的一類重要的第二信使。目前在枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌以及單核細(xì)胞增生李斯特菌等[1-5]常見的致病菌中都檢測(cè)到了c-di-AMP。近年來(lái)，c-di-AMP在細(xì)菌中的功能漸漸明朗，它參與細(xì)菌的生長(zhǎng)、生物被膜的形成、細(xì)胞壁的代謝平衡、脂肪酸的合成、鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生命過(guò)程，同時(shí)與DNA的完整性以及細(xì)菌的致病毒力等[6-7]方面也相關(guān)。然而，厚壁菌在缺乏c-di-AMP的條件下不能生長(zhǎng)，但c-di-AMP的過(guò)多積累影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此c-di-AMP也被認(rèn)為是一種毒素[8]。此外，c-di-AMP在宿主細(xì)胞與病原菌互作過(guò)程中激活固有免疫方面也發(fā)揮著重要作用。

1 c-di-AMP的合成與降解

c-di-AMP 在細(xì)菌中的代謝受c-di-AMP合成酶(也稱為二腺苷酸環(huán)化酶)和降解酶(磷酸二酯酶)的精密調(diào)控。目前認(rèn)為c-di-AMP是由兩分子的ATP或者兩分子的ADP經(jīng)環(huán)化酶 (diadenylatecyclase,DAC) 作用后形成一種環(huán)狀分子，可被磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE) 分解為一個(gè)線性分子pApA 或者兩分子的AMP，如圖1所示。

圖1 c-di-AMP的合成與分解[9]

1.1 c-di-AMP的合成酶

枯草芽胞桿菌的DisA 是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)c-di-AMP 合成酶，它含有具有催化活性的DAC結(jié)構(gòu)域，在許多細(xì)菌和古細(xì)菌中均發(fā)現(xiàn)了含有DAC結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，該類蛋白的DAC結(jié)構(gòu)域中均存在RHR(Arg-His-Arg)和DGA(Asp-Gly-Ala)兩個(gè)氨基酸保守基序[10-11]。目前含有DAC結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)主要有DisA、CdaS、CdaM和 CdaA[12]四種類型。CdaA和CdaS 的氨基酸同源性較高，達(dá)到40%，而DisA與CdaA和CdaS的同源性僅為19%[12-13]。大多數(shù)細(xì)菌中只含有一種類型的DAC結(jié)構(gòu)域，但是在梭菌屬中含有CdaA和DisA兩種類型的DAC結(jié)構(gòu)域，在枯草芽胞桿菌中含有DisA、CdaA和CdaS三種類型的DAC結(jié)構(gòu)域。

目前，關(guān)于c-di-AMP合成酶催化合成c-di-AMP的機(jī)制研究較多的是枯草芽胞桿菌中的DisA[14]。研究發(fā)現(xiàn)DisA在胞子的形成中還是調(diào)節(jié)DNA修復(fù)機(jī)制的一種重要關(guān)卡蛋白。在枯草芽胞桿菌中DisA與一種DNA修復(fù)蛋白R(shí)adA共同編碼操縱子，DisA通過(guò)掃描DNA并檢測(cè)到損傷的DNA后，發(fā)出終止胞子形成信號(hào)，DisA與RadA修復(fù)DNA損傷后，重新啟動(dòng)胞子形成途徑[12]。CdaA(也稱為DacA)是在金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿隱秘桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌等多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的具有DAC結(jié)構(gòu)域的一種c-di-AMP環(huán)化酶[15-16]，CdaA已被證明參與維持細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)以及控制鉀離子通道的作用[13,17,18]。在金黃色葡萄球菌中，發(fā)現(xiàn)DacA的活性受磷酸葡糖胺變位酶glmM基因的控制，GlmM可抑制DacA合成c-di-AMP，而GlmM自身的活性不受DacA的影響[19-20]。CdaS僅在產(chǎn)生胞子的芽胞桿菌屬和梭菌屬中發(fā)現(xiàn)，并且只在胞子萌發(fā)期間表達(dá)[21]。CdaM是首次在肺炎支原體中被發(fā)現(xiàn)的具有DAC結(jié)構(gòu)域的c-di-AMP環(huán)化酶，并且與枯草芽胞桿菌中的CdaS的DAC結(jié)構(gòu)域相近，在對(duì)肺炎支原體CdaM的缺失突變體進(jìn)行篩選時(shí)，未得到相應(yīng)的突變體，說(shuō)明c-di-AMP對(duì)肺炎支原體的存活至關(guān)重要[22]。

本課題組在綿羊肺炎支原體Y98株中首次發(fā)現(xiàn)了c-di-AMP，經(jīng)生物信息學(xué)分析與異源表達(dá)，初步確定了綿羊肺炎支原體中合成c-di-AMP的酶DisaM。該酶共有203個(gè)氨基酸，含有一個(gè)DAC結(jié)構(gòu)域，蛋白大小為18 kD，與其他細(xì)菌的c-di-AMP合成酶不同的是，它只含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。該蛋白雖然也含有保守的RHR(Arg-His-Arg)和DGA(Asp-Gly-Ala)基序，但是整體序列與已報(bào)道的c-di-AMP 合成酶序列同源性很低。

1.2 c-di-AMP的降解酶

c-di-AMP的降解酶(磷酸二酯酶，PDE)最早是在枯草芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)的，隨后在金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和鏈球菌中也發(fā)現(xiàn)了PDE[23]。PDE水解c-di-AMP，生成線性的磷酸腺苷(pApA)分子或兩分子的AMP[24]。已發(fā)現(xiàn)能夠降解c-di-AMP的PDE有三類：PgpH、GdpP和Pde2[23,25]。在不同的細(xì)菌種類中含有不同的PDE，但是在單核細(xì)胞增生李斯特菌中含有GdpP和PgpH兩種磷酸二酯酶，在鏈球菌和葡萄球菌中也含有兩種磷酸二酯酶，分別是GdpP和Pde2[23]。

在PDE中，主要包含DHH/DHHA1(DHH代表Asp-His-His)和HD兩種類型的結(jié)構(gòu)域。GdpP是含有DHH/DHHA1的結(jié)構(gòu)域蛋白[23,25]，該蛋白包含有兩個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，一個(gè)PAS感受結(jié)構(gòu)域，一個(gè)高度異化的GGDEF結(jié)構(gòu)域，一個(gè)DHH結(jié)構(gòu)域以及DHH伴隨結(jié)構(gòu)域DHHA1結(jié)構(gòu)域(如圖2所示)。GdpP中的DHH/DHHA1結(jié)構(gòu)域?qū)-di-AMP水解成pApA[25]。GdpP中的PAS結(jié)構(gòu)域還可與血紅素結(jié)合，血紅素抑制其磷酸酯酶活性[26]。Pde2是在肺炎鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的含有DHH/DHHA1結(jié)構(gòu)域的蛋白，該蛋白不僅可以水解c-di-AMP，還可以水解其分解產(chǎn)物pApA，最終生成AMP[27-28]。Pde2對(duì)胞內(nèi)pApA和c-di-AMP的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[29-30]。PgpH是在單核細(xì)胞增生李斯特菌中發(fā)現(xiàn)的含有HD結(jié)構(gòu)域的蛋白，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在其他細(xì)菌中也廣泛分布[23,31]。PgpH在其C-末端具有催化作用的HD結(jié)構(gòu)域，可將c-di-AMP降解為5′-pApA，PgpH除HD結(jié)構(gòu)域外，還具有N-末端的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)[31]。

圖2 GdpP、Pde2和PgpH的結(jié)構(gòu)示意圖

2 c-di-AMP在細(xì)菌中的結(jié)合蛋白

c-di-AMP在信號(hào)通路中的不同作用取決于其與靶分子的結(jié)合，因此研究細(xì)菌中c-di-AMP的結(jié)合分子以及其結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于揭示c-di-AMP的機(jī)制至關(guān)重要[32]。最常見的方法是使用c-di-AMP親和柱從細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)提取物中分離結(jié)合蛋白，并進(jìn)行質(zhì)譜分析。目前，已發(fā)現(xiàn)c-di-AMP的結(jié)合蛋白包括酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等幾類，它們通過(guò)與c-di-AMP結(jié)合進(jìn)行變構(gòu)調(diào)節(jié)(見表1)。此外，c-di-AMP還可與RNA核糖開關(guān)結(jié)合，共同調(diào)控細(xì)菌的生理活動(dòng)[33-34]。

表1 在細(xì)菌中c-di-AMP的結(jié)合蛋白

3 c-di-AMP激活宿主細(xì)胞通路的受體蛋白

c-di-AMP在真核宿主細(xì)胞抗感染的固有免疫中發(fā)揮著重要作用。病原菌進(jìn)入到宿主細(xì)胞后，釋放c-di-AMP，與真核宿主細(xì)胞中的受體結(jié)合并激活相應(yīng)的信號(hào)通路。到目前為止，已鑒定出宿主細(xì)胞中c-di-AMP的主要受體有STING、DDX41、RECON和ERAdP四種。

3.1 STING

STING(也稱為MYPS、MITA、ERIS或TMM173)是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白質(zhì)，是將核酸的上游細(xì)胞溶質(zhì)與下游細(xì)胞因子連接起來(lái)的膜上銜接蛋白[41]。c-di-AMP與Sting結(jié)合，激活TBK1介導(dǎo)的干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3的磷酸化，被磷酸化的IRF3進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)I型IFN的產(chǎn)生[42]。此外，由cGAS酶合成的2′5′-cGAMP是真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中DNA的主要傳感器之一，也可以激活STING信號(hào)通路[43]。

3.2 DDX41

Parvatiyar等[44]發(fā)現(xiàn)了DDX41是由ddx41基因編碼的RNA解旋酶，能夠作為模式識(shí)別受體(Pattern Recognition Receptor, PRR)識(shí)別宿主細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌和病毒所產(chǎn)生的病原相關(guān)模式分子(Pathogen Associated Molecular Pattern, PAMPs)，從而激活STING依賴的天然免疫應(yīng)答過(guò)程。DDX41作為PRR可以識(shí)別c-di-GMP和c-di-AMP，結(jié)合STING激活TBK1、NF-κB和IRF3相關(guān)天然免疫信號(hào)通路[45-47]。在人或小鼠細(xì)胞中通過(guò)shRNA敲減DDX41的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致固有免疫相關(guān)基因表達(dá)減弱，使由c-di-GMP和c-di-AMP[48-49]引發(fā)的STING-TBK1-IRF3的信號(hào)通路受阻。在同一途徑中，RNA解旋酶DDX41也結(jié)合c-di-AMP和DNA，協(xié)同激活STING[44]。

3.3 RECON

2017年Mcfarland等[50]用免疫磁珠的方法分離到了細(xì)菌CDNs在真核宿主細(xì)胞中的一種新的受體-氧化還原酶(RECON也稱為AKR1C13)，進(jìn)一步研究表明，RECON主要存在于肝組織中，與STING相反，該蛋白僅結(jié)合c-di-AMP和3′3′-cGAMP，不結(jié)合c-di-GMP或2′3′-cGAMP。c-di-AMP與RECON結(jié)合，抑制其酶活性，RECON酶活性的喪失，增加了NF-κB的活性，進(jìn)而激活炎癥因子的表達(dá)，降低細(xì)菌的存活率。

3.4 ERAdP

c-di-AMP除了與DDX41和STING結(jié)合促進(jìn)I型IFN的產(chǎn)生外，還通過(guò)其更具特異性的ER銜接蛋白識(shí)別并激活NF-κB信號(hào)通路[51-52]。由于ERAdP在NK細(xì)胞中介導(dǎo)泛素-結(jié)合酶Ubc13激活NF-κB信號(hào)通路[53]，Xia等[54]在2018年發(fā)現(xiàn)了ERAdP與c-di-AMP具有較高的親和力，c-di-AMP與ERAdP的C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致ERAdP二聚化，激活TAK1激酶，活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。進(jìn)一步研究表明，敲除Cnep1r1fl/flLyz2-Cre 小鼠的ERAdP和TAK1，易感染單核細(xì)胞增生李斯特菌，說(shuō)明ERAdP介導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生對(duì)控制細(xì)菌的感染至關(guān)重要[54]。

4 展 望

細(xì)菌能準(zhǔn)確感知周圍環(huán)境條件的變化并進(jìn)行回應(yīng)，其第二信使分子在此過(guò)程中起重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，自2008 年Romling發(fā)現(xiàn)c-di-AMP 以來(lái)，已在多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，并引發(fā)越來(lái)越多的關(guān)注。c-di-AMP的水平升降可導(dǎo)致一系列細(xì)菌表型發(fā)生改變，調(diào)控一系列重要的細(xì)胞進(jìn)程。c-di-AMP對(duì)病原菌的致病力具有一定的調(diào)控能力，可以作為藥物篩選的靶標(biāo)，在防止致病菌的感染方面有一定的應(yīng)用潛能。c-di-AMP能夠激發(fā)機(jī)體固有免疫應(yīng)答，已有報(bào)道將其作為佐劑應(yīng)用于黏膜以及全身免疫[55-57]。

病原菌感染細(xì)胞，通過(guò)釋放c-di-AMP與胞內(nèi)的STING、DDX41、RECON和ERAdP等受體結(jié)合，激活固有免疫反應(yīng)，但是相關(guān)的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入解析。此外，真核宿主細(xì)胞中新的受體分子及相關(guān)效應(yīng)蛋白有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。然而，鑒于多種致病菌中c-di-AMP的發(fā)現(xiàn)及其對(duì)致病作用的影響，深入研究c-di-AMP在細(xì)胞中的信號(hào)通路尤為關(guān)鍵，對(duì)這些問題的闡釋, 將有利于解析病原菌逃逸宿主固有免疫的機(jī)制, 為有效控制和治療感染相關(guān)的疾病提供新策略和新思路。