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    缺血性腦卒中CARD8 rs2043211和NLRP3 rs10754558的遺傳共關(guān)聯(lián)作用☆

    2019-06-14 07:38:54呂潔蔣曉山譚超張晶彭湘暉林紅梅
    中國神經(jīng)精神疾病雜志 2019年5期
    關(guān)鍵詞:等位基因多態(tài)性基因型

    呂潔 蔣曉山 譚超 張晶 彭湘暉 林紅梅

    NLRP3炎癥小體是由NLRP3、接頭蛋白凋亡相關(guān)微粒蛋白 (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、 效應(yīng)蛋白 Procaspase-1和銜接蛋白胱天蛋白酶募集域蛋白8(caspase recruitment domain-containing protein 8,CARD8)組成的一種大分子多蛋白復(fù)合體。研究證明,NLRP3炎癥小體的激活在缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用,成為炎癥級聯(lián)反應(yīng)關(guān)鍵的分子通路,而通過調(diào)控NLRP3炎癥小體的活性可保護神經(jīng)功能,改善預(yù)后[1-2]。至目前為止,國內(nèi)外關(guān)于NLRP3炎癥小體組分基因的多態(tài)性與IS的關(guān)聯(lián)研究僅有兩項[3-4],且均是針對單一組分基因的研究,故本研究采用TaqManMGB RT-PCR技術(shù)進(jìn)行基因分型,分析NLRP3炎癥小體組分基因的多態(tài)性CARD8 rs2043211及NLRP3 rs10754558在IS亞型發(fā)病風(fēng)險中的共關(guān)聯(lián)作用,以期為IS的篩查、預(yù)防以及生物治療靶點的開發(fā)提供新的理論依據(jù)。

    1 對象與方法

    1.1 研究對象采用病例對照研究方法,病例組選擇于2015~2017年在廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的病程1周內(nèi)的急性IS病例并連續(xù)入組,納入標(biāo)準(zhǔn):①符合中國急性缺血性腦卒中診治指南 2018的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]:a.急性起病;b.局灶神經(jīng)功能缺損;c.影像學(xué)出現(xiàn)責(zé)任病灶或癥狀體征持續(xù)24 h以上;②年齡18~85歲;③中國南方漢族人群;④排除腦外傷、腦腫瘤、已知的單基因腦血管病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、腦出血、短暫腦缺血發(fā)作及與自身免疫或炎癥相關(guān)的疾病。依據(jù)改良的TOAST病因分型診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],將AT型(n=145)及SAD型(n=89)IS納入本研究。對照組采用調(diào)查問卷的形式收集與病例組相匹配的來自健康體檢中心的人群,除了無腦梗死病史外,均符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)。所有研究對象均已簽署知情同意。本研究已獲得我院倫理委員會的批準(zhǔn) (倫理編號:2017NXSYYEC-022)。

    1.2 標(biāo)本采集病例組于入院當(dāng)天,對照組于體檢當(dāng)天取肘靜脈血2 mL置于EDTA抗凝管中,采用全血DNA快速提取試劑盒(購于深圳亞能生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA。

    1.3 基因分型采用TaqMan MGB實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)在LightCycler 480 II(Roche,瑞士)熒光定量PCR儀上進(jìn)行CARD8 rs2043211、NLRP3 rs10754558的基因分型 (引物序列見表 1)。 PCR 反應(yīng)體系(10 μL)為:2×Taq-Man Fast qPCR Master Mix 5 μL,10μmol/L For wardPrimer0.25μL,10μmol/L ReversePrimer0.25μL,10 μmol/L probe 0.2+0.2 μL,dd H2O 3.1 μL,Template DNA 1.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃×4 min~(95 ℃×7 s~60 ℃×40 s~72 ℃×1 s)×40 個循環(huán)。每個96孔板設(shè)置兩個空白對照。應(yīng)用LightCycler 480 Software 1.5分析分型結(jié)果。隨機挑選10%的樣本,利用第一代測序法對基因分型的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗證,結(jié)果一致率為100%。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法通過Haploview 4.2檢驗研究樣本對照組是否符合Hardy-Weinberg平衡,采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。分別用t檢驗、方差分析和χ2檢驗對計量資料和分類資料進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計,以非條件logistic回歸模型計算比值比(OR)、95%可信區(qū)間(CI)、SNP與環(huán)境因素的交互作用、單一基因與疾病的交互作用、基因與基因的交互作用。以上所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗CARD8 rs2043211與NLRP3 rs10754558在對照組中的基因型頻率分布均符合 Hardy-Weinberg平衡(rs10754558:χ2=1.98,P=0.16;rs2043211:χ2=0.27,P=0.60)。

    2.2 一般情況性別、民族、吸煙狀況、HDL-C、高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q

    冠)情況在AT組、SAD組和對照組中的分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001 或P<0.05);HsCRP 在對照組中未檢測,但在AT組和SAD組中的水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(見表 2)。

    2.3 SNP-臨床指標(biāo)交互作用在AT組與對照組的比較中,rs10754558分別與吸煙、高血壓、冠心病的交互作用升高發(fā)病風(fēng)險;rs2043211與HDL-C的交互作用降低發(fā)病風(fēng)險,與吸煙、高血壓、冠心病的交互作用升高發(fā)病風(fēng)險。在SAD組與對照組的比較中,rs10754558與高血壓存在交互作用,rs2043211與吸煙、高血壓存在交互作用,均升高發(fā)病風(fēng)險(見表3)。

    2.4 SNP與缺血性腦卒中的關(guān)聯(lián)分析rs10754558和rs2043211的小等位基因頻率(MAF)及不同遺傳模式下的基因型頻率分布在AT組、SAD組分別與對照組的比較中其差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>

    0.05)(見表 4)。

    2.5 SNP-SNP交互作用如表 5所示,NLRP3 rs10754558或CARD8 rs2043211單一基因的多態(tài)性位點的基因型頻率分布,AT組、SAD組分別與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),但是進(jìn)行兩個基因多態(tài)性位點的交互作用分析時發(fā)現(xiàn),AT組與對照組比較,rs10754558位點的CG基因型與rs2043211位點的AT基因型存在交互作用,且增加發(fā)病風(fēng)險(P<0.01)。

    3 討論

    NLRP3基因被廣泛研究的多態(tài)性位點是rs35829419(c.2113C>A,p.Q705K)及rs10754558,均為“功能獲得性的”突變[7]。人類NLRP3 rs10754558位點位于NLRP3基因的3‘UTR中,其小等位基因G可導(dǎo)致NLRP3mRNA表達(dá)的增高[7]。CARD8基因功能性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)rs2043211(c.30T>A,p.C10X)位于CARD8基因第五個外顯子內(nèi),是CARD8基因模版鏈上A堿基到T堿基的改變。許多學(xué)者已對上述NLRP3炎癥小體單一組分基因的多態(tài)性對眾多慢性炎癥性疾病易感性的影響進(jìn)行了關(guān)聯(lián)研究[8-11],然而結(jié)論是相互矛盾的,這種矛盾可能緣于炎癥小體復(fù)合物其他組分基因SNP的存在[12]。

    表1 CARD8 rs2043211和NLRP3 rs10754558基因分型的引物序列

    表2缺血性腦梗死病例組和對照組的一般情況

    表3 SNP-臨床指標(biāo)交互作用

    表4 SNP與缺血性腦卒中的小等位基因及基因型關(guān)聯(lián)分析

    表5 SNP-SNP交互作用

    我們的研究并沒有發(fā)現(xiàn)NLRP3 rs10754558或CARD8 rs2043211單一基因的SNP與IS兩個亞型有任何關(guān)聯(lián)作用,這與2014年BAI[3]及2015年ZHU[4]的研究結(jié)果矛盾,他們的研究發(fā)現(xiàn)CARD8 rs2043211的小等位T在隱性遺傳模式下降低IS發(fā)生的風(fēng)險[3]、NLRP3 rs10754558位點的小等位基因 G顯著增高IS進(jìn)展的風(fēng)險[4],上述兩項研究均為針對NLRP3炎癥小體單一組分基因多態(tài)性的分析。我們認(rèn)為結(jié)論矛盾可能緣于:在研究NLRP3炎癥小體這一多蛋白復(fù)合物時,孤立研究單一組份基因的多態(tài)性難以全面而客觀地反映NLRP3炎癥小體在免疫炎癥機制中的遺傳學(xué)效應(yīng),尤其是對于IS這一典型的由多基因控制、表型呈間斷分布的復(fù)雜性疾病來說。而探索多位點基因型組合與某一疾病的關(guān)聯(lián)的研究方興未艾,但也僅限于NL RP3的另一個SNP rs35829419與CARD8 rs2043211的交互作用分析,在缺血性腦血管病這一領(lǐng)域,相關(guān)研究尚未開展。

    因此,在本研究中我們對基因間的交互作用也進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)基因型組合CARD8 rs2043211/NLRP3 rs10754558AT/CG顯著增加AT型IS的患病風(fēng)險,在SAD型IS中并未發(fā)現(xiàn)此種關(guān)聯(lián),這與以往研究所發(fā)現(xiàn)的與其他慢性炎癥性疾病相關(guān)聯(lián)的基因型組合不同,且所探討的NLRP3的SNP位點不同。RBOERTS等分別在對腹主動脈瘤[13]和克羅恩?。–rohn’s disease,CD)[14]的研究中發(fā)現(xiàn):CARD8 rs2043211和NLRP3 rs35829419存在顯著相關(guān),當(dāng)一個SNP的次等位基因和另一個SNP的野生純合型共同存在時對疾病具有保護效應(yīng)。我們的研究并未發(fā)現(xiàn)一個SNP的次等位基因和另一個SNP的野生純合型共同存在時(rs2043211/rs10754558AA/CG、AA/GG、AT/CC、TT/CC)對 IS的保護作用,但也并未增加疾病風(fēng)險,這可能與本研究中的樣本量偏少有關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)均可用NLRP3和CARD8的生物學(xué)特性來解釋:當(dāng)配體與NLRP3蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域結(jié)合后NLRP3被活化,通過PYD-PYD相互作用與ASC結(jié)合,由ASC的CARD結(jié)構(gòu)域招募Pro-caspase-1形成炎癥小體,并自身激活,活化后的caspase-1對Pro-IL-1β和Pro-IL-18等底物進(jìn)行切割,最終促進(jìn)先天免疫中極為重要的炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-18的成熟及分泌,從而廣泛參與缺血性腦損傷的全過程[15]。近來的研究表明,CARD8是通過FIIND結(jié)構(gòu)域與NLRP3的NOD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合抑制NLRP3的寡聚化來反向調(diào)控內(nèi)源性NLRP3炎癥小體活性的[16];另一方面,CARD8可以負(fù)向調(diào)控 NF-κB的激活,并同時擁有抗凋亡的能力[17-18]。CARD8 rs2043211的小等位基因形成終止密碼(Cys10Stop)并導(dǎo)致產(chǎn)生截斷蛋白,從而失去了抑制NF-κB活性的能力,引致作為NLRP3炎癥小體底物的Pro-IL-1β的過多產(chǎn)生[19]。但如果沒有NLRP3 rs35829419“功能獲得性”的小等位基因的存在,Pro-IL-1β將不會被轉(zhuǎn)化為過多、成熟的IL-1β,反之亦然[14]。因此上述的基因型組合并不增加患病風(fēng)險。

    不同于上述研究分析兩個基因所有的基因型組合,有些學(xué)者將研究群體根據(jù)兩個基因均不存在變異的等位基因(即均為野生純合型,C10X/Q705K+/+)和兩個基因均至少存在一個變異的等位基因(C10X/Q705K-/-)劃分,KASTBOM 等[20]發(fā)現(xiàn)攜帶C10X/Q705K-/-的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的患者具有更高的疾病活性和更高的接納TNF阻滯治療的可能性,上述發(fā)現(xiàn)在男性CD患者中被進(jìn)一步印證[21]。2015年KASTBOM等[22]進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),攜帶基因型組合C10X/Q705K-/-的RA患者罹患卒中和短暫性腦缺血發(fā)作的風(fēng)險增加。我們的研究發(fā)現(xiàn),rs2043211/rs10754558-/-(TT/CG、TT/GG、AT/GG、AT/CG)中AT/CG基因型組合顯著增加IS的患病風(fēng)險,這與上述研究結(jié)果相吻合,提示了CARD8的SNPrs2043211只有在與NLRP3的 “功能獲得性”SNP共同存在時才能激活炎癥小體,生成更多的成熟的IL-1β,因此增加疾病的發(fā)病風(fēng)險。

    但我們也看到,rs2043211/rs10754558的 TT/CG、TT/GG基因型組合與IS的易患性也無關(guān),且至目前為止,在CARD8和NLRP3基因多態(tài)性的組合效應(yīng)的研究中仍然存在矛盾性的結(jié)論,一些研究也并未觀察到NLRP3 Q705K和CARD8 C10X的交互作用對RA的易感性有任何影響[23],這些陰性的結(jié)果可能是因為大多數(shù)攜帶CARD8C10X的患者是在C10X位點的下游啟動了CARD8亞型(T47)的轉(zhuǎn)錄,所以仍繼續(xù)表達(dá)一個略小然而功能完備的CARD8[24],而攜帶C10X純合型的患者可能會因為T47亞型而具備功能性的CARD88蛋白[25],而非截斷蛋白,因此進(jìn)一步研究已鑒定出的CARD8亞型的功能以評估其抑制NF-κB活性的能力是很重要的。

    同時我們的實驗亦證實了AT組較SAD組有更高的HsCRP水平,提示AT組可能存在的免疫炎癥反應(yīng)機制。在此,我們推測,NLRP3炎癥小體組分基因多態(tài)性的組合對IS的遺傳易患模型:即攜帶CARD8 rs2043211和NLRP3 rs10754558均為雜合子的人群更易罹患AT型腦梗死。而臨床上AT型較SAD型IS具有更嚴(yán)重的癥狀和更兇險的預(yù)后,因此,此基因型組合可幫助我們鑒定出潛在的對靶向治療IL-1β信號通路有效的AT型IS患者,減輕癥狀并改善預(yù)后。

    鑒于本研究樣本量的局限及研究的SNP位點數(shù)量的局限,還需要具有更多樣本量、分析NLRP3炎癥小體組分基因更多SNP位點間交互作用的多中心研究進(jìn)一步闡明多位點的基因型組合與IS發(fā)病間的共關(guān)聯(lián)作用,這些研究的進(jìn)行將有助于開發(fā)新的預(yù)測、預(yù)防和治療缺血性腦血管病、自身免疫性疾病等與炎癥相關(guān)疾病的有力策略。

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