植物乳桿菌Lp-G18谷氨酰胺合成酶活力發(fā)酵工藝優(yōu)化

徐 煜，蔣德意，韓 迪

（潤盈生物工程（上海）有限公司，上海 200436）

乳桿菌是一類傳統(tǒng)的、普遍被認(rèn)為安全的益生菌，在酸乳、飲料、菌粉或泡菜中都有使用[1]。植物乳桿菌是常見的益生菌之一，具有良好的耐酸、耐膽鹽能力，并具有許多益生功能，如調(diào)節(jié)腸道健康、抗氧化、抗真菌、預(yù)防便秘和腹瀉、防治上呼吸道感染、抑制致病菌侵入和調(diào)節(jié)人體免疫等作用[2]。同時，植物乳桿菌還具有運(yùn)動保健功能，具有緩解肌肉疲勞和損傷的能力[3]。植物乳桿菌緩解肌肉疲勞及損傷的能力與其谷氨酰胺的合成能力相關(guān)。

谷氨酰胺是一種重要的醫(yī)藥原料[4]，具有治療胃潰瘍、緩解運(yùn)動綜合征和運(yùn)動疲勞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及增強(qiáng)腦神經(jīng)機(jī)能等生理功能[5]。在原核生物體內(nèi)，谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）催化谷氨酸和銨離子縮合，是谷氨酰胺形成的重要途徑之一[6]。植物乳桿菌谷氨酰胺合成酶能催化谷氨酸與銨反應(yīng)生成谷氨酰胺，現(xiàn)有的GS活力發(fā)酵技術(shù)主要針對工業(yè)合成菌棒狀桿菌（Corynebacterium）[7]，對可食用的益生菌，如植物乳桿菌GS的研究很少[8]。GS活力的植物乳桿菌在與運(yùn)動保健相關(guān)的食品、保健品或醫(yī)藥原料方向均有廣闊的應(yīng)用潛力。

本研究對植物乳桿菌Lp-G18的GS活力發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，考察金屬離子、L-谷氨酸添加、氮減少處理和碳源調(diào)整對發(fā)酵后的植物乳桿菌Lp-G18菌株GS活力的影響，為植物乳桿菌的深度開發(fā)應(yīng)用及植物乳桿菌GS的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌Lp-G18，由某菌種保藏中心提供；凍干保護(hù)劑：含蔗糖50 g/L、脫脂乳粉150 g/L。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MRS）：含葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸氫二胺2 g/L、乙酸鈉5 g/L、七水硫酸鎂0.25 g/L、一水硫酸錳0.05 g/L、吐溫-80 1 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2102C紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；FD8-6真空冷凍干燥機(jī) 上海穎漢化工科技有限公司；DL-5M冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；5424R離心機(jī) 德國Eppendorf公司；MB-102金屬浴溫控儀 杭州博日科技有限公司；JN-02C高壓勻質(zhì)儀 廣州聚能生物科技有限公司；GS活性測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；NanoDrop 2000微量分光光度計 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與接種發(fā)酵

將－80 ℃冷凍保藏的植物乳桿菌Lp-G18菌株接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h；將發(fā)酵后的菌液以2%的接種量接種于2 L MRS培養(yǎng)基或相應(yīng)調(diào)整的培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵12 h，收菌；用紫外分光光度計于600 nm波長處檢測菌體生長情況。

1.3.2 菌體收集及凍干菌粉制備

采用冷凍離心機(jī)對發(fā)酵液在溫度4 ℃、轉(zhuǎn)速7 000 r/min條件下離心10 min，離心結(jié)束后去除上清，并收集菌體沉淀，將菌體沉淀和凍干保護(hù)劑按照質(zhì)量比1∶1進(jìn)行重懸；將重懸均勻的乳化液于－80 ℃冰箱中冷凍4 h后，立即置于真空冷凍干燥機(jī)中，真空冷凍抽干12 h，將凍干的菌餅粉碎，即得凍干菌粉。

1.3.3 無細(xì)胞提取物制備

將1 g制備好的凍干菌粉重懸于10 mL去離子水中，4 ℃、4 000 r/min離心15 min后，去除凍干保護(hù)劑；將菌體沉淀用去離子水重懸，再次離心去除上清，同樣步驟重復(fù)1 次；將洗滌后的菌體沉淀重懸于10 mL 0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6.5）中，調(diào)節(jié)高壓勻質(zhì)儀至壓力160 MPa，將重懸好的菌液循環(huán)破菌20 次；收集菌體破碎液，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為無細(xì)胞提取物。

1.3.4 GS活力分析

總蛋白濃度由A280nm測得。參考Bender等[9]的方法，使用GS活力測定試劑盒測定GS活力。按照試劑盒說明書中的測定步驟，測定540 nm波長處的吸光度（A）。ΔA=A測定管－A對照管。將每毫克蛋白在每毫升反應(yīng)體系中，每分鐘使540 nm波長處的吸光度變化0.01定義為1 個酶活力單位。GS活力按照下式計算。

式中：V為反應(yīng)體系總體積/mL；V樣為加入樣本體積/mL；t為反應(yīng)時間/min；Cpro為樣本蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

比活力定義為每批發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵的酶活力與同批基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵的酶活力比值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選擇“無重復(fù)雙因素分析”分析數(shù)據(jù)差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌Lp-G18的生長曲線

圖1 植物乳桿菌Lp-G18的生長曲線Fig. 1 Growth curve of L. plantarum Lp-G18

測定植物乳桿菌Lp-G18在MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)時的生長曲線。由圖1可知，植物乳桿菌Lp-G18生長延滯期為5 h，培養(yǎng)10 h后進(jìn)入生長穩(wěn)定期，13 h開始進(jìn)入凋亡期。

2.2 發(fā)酵時間對GS活力的影響

圖2 植物乳桿菌Lp-G18發(fā)酵不同時間的GS活力Fig. 2 Effects of fermentation time on GS activity of L. plantarum Lp-G18 fermentation

對植物乳桿菌Lp-G18指數(shù)生長末期（9 h）、穩(wěn)定期（10～12 h）及凋亡初期（14 h）的GS活力進(jìn)行考察。由圖2可知，穩(wěn)定期GS活力可以維持較高水平，其中在穩(wěn)定期末期12 h時，酶活力最高。

2.3 培養(yǎng)基成分對GS活力的影響

2.3.1L-谷氨酸濃度對GS活力的影響

圖3 L-谷氨酸濃度對植物乳桿菌Lp-G18發(fā)酵GS活力的影響Fig. 3 Effects of L-glutamic acid supplementation on GS activity of L. plantarum Lp-G18 fermentation

由圖3可知，添加L-谷氨酸可以提高GS活力，當(dāng)L-谷氨酸濃度為60 mmol/L時，GS活力最高，提高46%，而進(jìn)一步提高培養(yǎng)基中L-谷氨酸的濃度，GS活力有所下降。

2.3.2 金屬離子濃度對GS活力的影響

圖4 一水硫酸錳濃度對植物乳桿菌Lp-G18發(fā)酵GS活力的影響Fig. 4 Effects of manganese supplementation on GS activity of L. plantarum Lp-G18 fermentation

考察基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增加Mg2＋和Mn2＋濃度對植物乳桿菌Lp-G18 GS活力的影響。由圖4可知，發(fā)酵時增加Mn2＋濃度，GS活力有所提高，當(dāng)Mn2＋濃度為1.5 mmol/L時，GS活力最高，提高44%。

圖5 七水硫酸鎂濃度對植物乳桿菌Lp-G18發(fā)酵GS活力的影響Fig. 5 Effects of magnesium supplementation on GS activity ofL. plantarum Lp-G18 fermentation

由圖5可知，當(dāng)Mg2＋濃度為20～50 mmol/L時，GS活力有不同程度的提高，當(dāng)Mg2＋濃度為20 mmol/L時GS活力最高，提高43%，繼續(xù)增加Mg2＋濃度，GS活力開始下降。

2.3.3 碳源濃度對GS活力的影響

圖6 葡萄糖濃度對植物乳桿菌Lp-G18發(fā)酵GS活力的影響Fig. 6 Effects of glucose supplementation on GS activity ofL. plantarum Lp-G18 fermentation

由圖6可知，葡萄糖濃度提高，GS活力也提高，當(dāng)葡萄萄糖濃度為333 mmol/L時，GS活力最高，提高65%。

2.3.4 檸檬酸氫二銨濃度對GS活力的影響

圖7 檸檬酸氫二銨濃度對植物乳桿菌Lp-G18發(fā)酵GS活力的影響Fig. 7 Effects of diammonium citrate supplementation on GS activity of L. plantarum Lp-G18 fermentation

由圖7可知，當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的檸檬酸氫二銨濃度從9.0 mmol/L降至4.5 mmol/L時，GS活力無明顯變化，而繼續(xù)將檸檬酸氫二銨濃度降至1.0 mmol/L時，GS活力略有增加，提高17%左右。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

上述結(jié)果表明，培養(yǎng)基成分中的L-谷氨酸、碳源、硫酸錳及硫酸鎂濃度變化對植物乳桿菌Lp-G18 GS活力影響較大，而檸檬酸氫二銨濃度變化影響較小。為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，對L-谷氨酸濃度、葡萄糖濃度和硫酸鎂濃度3 個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1）。由于硫酸錳在食品中的添加有限量要求，因此對培養(yǎng)基中硫酸錳的濃度不作優(yōu)化。

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

由表2可知，七水硫酸鎂濃度的極差R最大，對GS活力的影響最大，L-谷氨酸和葡萄糖濃度的極差值相差不大，葡萄糖濃度的極差值略高，3 種因素的影響大小順序?yàn)锽＞A＞C。葡萄糖濃度（A）、七水硫酸鎂濃度（B）和L-谷氨酸濃度（C）3 個因素水平指標(biāo)測定結(jié)果的最高平均值分別為k2、k1和k2，因此最佳試驗(yàn)組合條件為A2B1C2。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表3 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 3 Veriffication of orthogonal experiments

結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基：含葡萄糖40 g/L（222 mmol/L）、七水硫酸鎂4.92 g/L（20 mmol/L）、一水硫酸錳0.025 g/L、L-谷氨酸8.82 g/L（60 mmol/L）、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸氫二胺2 g/L、乙酸鈉5 g/L、吐溫-80 1 g/L，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行發(fā)酵3 次。由表3可知，優(yōu)化后GS活力為（18.57±0.80） U/mg，相比于對照組的GS活力（7.61±0.36） U/mg，提高了1.4 倍左右。

3 討 論

將培養(yǎng)基中的L-谷氨酸濃度繼續(xù)增加至80 mmol/L時，GS活力比對照組基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高38%，但是比60 mmol/L時有所下降，表明提高L-谷氨酸濃度的確能提高GS發(fā)酵活力，但是L-谷氨酸濃度過高可能會抑制GS活力。谷氨酸棒桿菌發(fā)酵過程中，當(dāng)谷氨酸濃度為50 mmol/L以下時，酶的比活力無明顯提高，而谷氨酸濃度為60 mmol/L時酶活力有明顯提升[9]。本研究中植物乳桿菌Lp-G18的GS活力發(fā)酵結(jié)果與之類似，當(dāng)L-谷氨酸濃度為30 mmol/L時，酶活力僅提高12%。

谷氨酸促進(jìn)GS活力提高的原因，推測類似于林肯鏈霉菌對GS活力的調(diào)節(jié)，谷氨酸對NH4＋等與林肯鏈霉菌GS的結(jié)合有解阻遏作用，谷氨酸的添加能促使GS活力保持在較高水平[10]。谷氨酸既是GS催化的底物，也可以作為植物乳桿菌生長的碳源[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸濃度為30～80 mmol/L時，發(fā)酵液得到的濕菌體產(chǎn)量比對照組培養(yǎng)基發(fā)酵高8%～10%左右。谷氨酸的添加同時也可以提高植物乳桿菌菌體產(chǎn)量。

錳離子對GS穩(wěn)定性及活力的保持有重要作用。對大腸桿菌[11]和沙門氏菌[12]GS晶體結(jié)構(gòu)的解析表明，GS活性中心是錳離子，同時底物和酶的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)分析表明，Mn2＋對維持酶的穩(wěn)定性至關(guān)重要[13]?；A(chǔ)培養(yǎng)基中增加Mn2＋濃度有利于植物乳桿菌Lp-G18 GS活力提高，推測Mn2＋可能參與了植物乳桿菌GS催化反應(yīng)，對酶活力及穩(wěn)定起重要作用。與Mg2＋濃度為2.0 mmol/L時，GS活力提高40%相比，Mn2＋濃度為1.5 mmol/L時，GS活力提高44%，因此Mn2＋濃度只需要添加至1.5 mmol/L，表明Mn2＋除了維持GS穩(wěn)定以外，還可能參與酶催化活性中心的組成，這個推測需要進(jìn)一步的晶體結(jié)構(gòu)解析研究支持。

Mg2＋對GS穩(wěn)定及活力保持也有重要作用。對頭狀輪生鏈霉菌[14]和米曲霉[15]GS活力發(fā)酵研究表明，Mg2＋和Mn2＋對維持酶的穩(wěn)定性至關(guān)重要。推測Mg2＋對植物乳桿菌GS穩(wěn)定性的維持也有重要作用，進(jìn)而促進(jìn)GS活力的提高。對谷氨酸棒桿菌的研究表明，提高M(jìn)g2＋濃度至50 mmol/L甚至更高，均有利于GS活力的提高[7]，但是在植物乳桿菌Lp-G18發(fā)酵中，Mg2＋濃度大于20 mmol/L時，GS活力開始下降，這表明了2 種菌GS活力的差異性。

糖源比例增加促進(jìn)GS活力的提高，在耐熱嗜酸古細(xì)菌[16]和谷氨酸棒桿菌[17]GS表達(dá)調(diào)控研究中均有報道。增加培養(yǎng)基中葡萄糖的比例能提高植物乳桿菌Lp-G18 GS活力，表明培養(yǎng)基中碳源和氮源比例的改變也可能調(diào)控植物乳桿菌Lp-G18 GS的表達(dá)。另一方面，增加葡萄糖的供給也可能造成植物乳桿菌Lp-G18生長中的“相對氮饑餓”狀態(tài)，進(jìn)而提高GS活力。

氮饑餓處理是提高GS活力的重要手段。研究表明，在初始氮源受到限制時，菌體在生長后期會出現(xiàn)氮饑餓狀態(tài)，這種狀態(tài)會使得菌體內(nèi)GS活力提高[18]。由于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中原本富含氮源，降低檸檬酸氫二銨的濃度不足以造成氮饑餓狀態(tài)，因此GS活力提高有限。在NH4Cl濃度較低的情況下，氯化銨對林肯鏈霉菌GS具有正協(xié)同作用，而NH4Cl濃度較高的情況下是負(fù)協(xié)同作用[19]。在本研究中，嘗試將培養(yǎng)基中的檸檬酸氫二銨用1 mmol/L的氯化銨替換，結(jié)果表明，GS活力下降40%，同時濕菌體產(chǎn)量下降10%，表明檸檬酸氫二銨不能替換。原因可能是氯化銨替換檸檬酸氫二銨后，培養(yǎng)基緩沖能力及菌體代謝受到影響；此外，NH4Cl濃度為1 mmol/L仍然過高，可能對酶活力起到負(fù)調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

添加L-谷氨酸、提高葡萄糖比例以及增加錳離子和鎂離子濃度等方式均能提高植物乳桿菌Lp-G18的GS活力。通過正交試驗(yàn)得到發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：葡萄糖40 g/L（222 mmol/L）、七水硫酸鎂4.92 g/L（20 mmol/L）、一水硫酸錳0.025 g/L、L-谷氨酸8.82 g/L（60 mmol/L）、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸氫二胺2 g/L、乙酸鈉5 g/L、吐溫-80 1 g/L。采用優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵得到的GS活力比原基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的酶活力提高了1.4 倍。本研究為高GS活力的植物乳桿菌生產(chǎn)發(fā)酵提供了有力支持。