瀉心湯不同劑量配伍的抗炎作用比較研究

魏江存，秦祖杰，謝 臻，陳 勇，潘真真，邱美雁，張 昕，闕祖亮

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瀉心湯不同劑量配伍的抗炎作用比較研究

魏江存1,2，秦祖杰1，謝 臻2，*陳 勇2，潘真真2，邱美雁1，張 昕2，闕祖亮2

（1. 廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院壯瑤藥研發(fā)中心，廣西，南寧 530201；2. 廣西中醫(yī)藥大學科學實驗中心，廣西，南寧 530200）

不同劑量配伍時瀉心湯的抗炎作用的對比分析，其抗炎作用有何影響。采用角叉菜膠導致小鼠炎癥模型，經口灌胃小鼠不同劑量配伍的瀉心湯水提液，連續(xù)灌胃給藥5 d后，測定足腫脹度；試驗測定丙二醛（MDA）含量和一氧化氮（NO）含量，查看其抗炎作用的活性。對比模型炎癥對照組，生理鹽水組、地塞米松組及各個劑量配伍組的足腫脹度均比模型對照組低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與劑量配伍4組相比較，劑量配伍2組足腫脹度下降，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。與模型對照組比較，生理鹽水組、地塞米松組及各個劑量配伍組MDA含量和NO含量均低于模型對照組組，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與劑量配伍4組進行對比，劑量配伍2組NO含量和MDA的含量均下降，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。三黃瀉心湯的不同劑量配伍時抗炎作用不一樣。

瀉心湯；劑量配伍；抗炎

三黃瀉心湯方劑記載于張仲景的《金匱要論》，由大黃、黃連、黃芩上藥三味熬制而成[1]，有清熱解毒、抗炎殺菌等藥用療效。中藥方劑配伍使用是中醫(yī)用藥的特點，由于中藥成分復雜，所以在復方配伍湯劑的使用過程中，單味藥物間的成分會相互作用，可以使湯劑中的成分發(fā)生明顯的變化，因此可能會對中藥湯劑中的臨床療效產生影響[2]。而大黃在加熱蒸炒炮制的過程中，其所含成分含量有一定的變化，藥理藥效也隨之發(fā)生變化，中藥炮制前后藥性改變，其化學成分含量增減變化[3-5]。大量試驗表明，瀉心湯的配伍中藥效的成分變化主要歸為兩點，一是酸、堿性兩種成分之間作用影響[6-7]；二是酸性成分之間互相作用影響。實驗發(fā)現(xiàn)該方配伍黃芩可使蒽醌類成分的溶出率增加[8-9]。

君藥大黃臨床應用除了使用生品外，也常使用炮制品，根據醫(yī)院臨床用藥的不同，大黃的使用，須炮制成不同炮制品。大黃在加熱蒸炒炮制的過程中，其所含的有效成分含量變化很大，其藥理藥效隨之發(fā)生變化[10-12]。中藥炮制前后藥性改變，其化學成分含量增減變化[13-14]，藥理有別，根據辨證施治的需要，合理選用不同的炮制品，才能提高中醫(yī)用藥的療效，避免產生毒副作用[15-16]。

研究表明[17-18]，黃芩的添加使得兩個組分在抑菌效果上有明顯的不同，對于某些特定菌的抗菌效果，黃芩的加入可以使抗菌力度增強。為探討瀉心湯配伍時對小鼠的抗炎作用影響，研究人員對此作了一系列的研究。中藥成分極其復雜，相關研究數(shù)據顯示，中藥配伍后成分含量的高低，是中藥配伍后藥理活性改變的原因[19]。因此，在本研究中，將研究不同劑量的瀉心湯對1%角叉菜膠炎癥模型小鼠的足腫脹度及其血清中MDA和NO含量差異，研究比較瀉心湯不同劑量配伍的抗炎作用，為進一步研究其藥理作用與劑量配伍的相關性提供理論依據。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 儀器

紫外可見分光光度計（島津儀器（蘇州）有限公司、UV-1780）；十萬分之一分析天平（德國sartorius公司，型號：BP211D）；XW-80A型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造公司，批號：1972）；移液槍（歷辰科技，型號：50~100 μL，100~1000 μL）；電熱恒溫數(shù)顯水浴鍋（上海一恒科技有限公司，型號：HWS24）；超純水儀（德國Merckmillioore公司，型號：D24UV）。

2.1.2 藥物與試劑

大黃（廣州康美藥業(yè)股份有限公司，批號：171008891）；黃連（廣州康美藥業(yè)股份有限公司，批號：171106631）；黃芩（廣州康美藥業(yè)股份有限公司，批號：171105141）；地塞米松片（臨汾寶珠制藥有限公司，批號：171107）；角叉菜膠（Sigma公司，批號：20160530）；生理鹽水（江西科倫藥業(yè)有限公司，批號：c17103202）；丙二醛測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20170306）；NO測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20170406）。

2.1.3 動物

SPF級昆明小鼠，雄性，體重：(20 ± 2 g)，動物質量合格證號：0001757，生產許可證號：SCXK桂2014－0002，均由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心供給。

2.2 實驗方法

2.2.1 不同劑量配伍的瀉心湯的制備

（1）劑量配伍1為大黃：黃芩：黃連=1:0.97:0.028；

（2）劑量配伍2為大黃：黃芩：黃連=1:1.70:0.096；

（3）劑量配伍3為大黃：黃芩：黃連=1:1.18:0.61；

（4）劑量配伍4為大黃：黃芩：黃連=1:0.5:0.5。

以上四個劑量配伍的瀉心湯加10倍量的水先浸泡30 min后加熱至微沸，控制微沸繼續(xù)煎煮20 min，濾布濾過，濃縮成浸膏，用時再配成相應濃度的藥液即可。

2.2.2 1%角叉菜膠混懸液的制備

取角叉菜膠0.5 g于50 mL超杯中，加入50 mL生理鹽水，水浴中邊加熱邊攪拌溶解，質量濃度為1 g/mL。此液需臨用前配制。

2.2.3 小鼠炎癥模型的建立與分組

取KM小鼠，雄性，小鼠適應性喂養(yǎng)2 d后，隨機分組，每組10只，分為如下7組：生理鹽水組，模型組，陽性藥組，劑量配伍1、2、3、4組。生理鹽水組和模型組給予氯化鈉注射劑，陽性藥組給予地塞米松（0.0065 g/kg），其余組均給予含大黃生藥量7.2 g/kg的瀉心湯水提液，連續(xù)5 d，最后一天給藥后1 h，除去生理鹽水組，其余組別在小鼠右足注射1%角叉菜膠0.05 ml/只致腫脹，左足為正常足，不給予注射。致腫4 h后眼球取血，3000 rpm低溫（-4℃）離心15 min，取血清-25℃存放，待測。取血處死后把小鼠左右兩足同一部位剪下，置于分析天平稱量，記錄重量。將小鼠右足重量減去左足重量得出結果為腫脹度，并計算腫脹抑制率。

腫脹抑制率（%）= [(模型對照組腫脹度—實驗組腫脹度)/模型對照組腫脹度]×100%。

2.2.4 血清中丙二醛（MDA）的測定

2.2.4.1 原理

過氧化脂質降解產物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰。

2.2.4.2 操作

取2.2.3項下的小鼠血清樣品按照丙二醛試劑盒說明書操作。具體操作見表1。

表1 MDA規(guī)范操作方法

2.2.4.3 計算公式

血清中MDA含量=（測定OD值-對照OD值）/(標準OD值-空白OD值)*標準品濃度*樣本測試前稀釋倍數(shù)

2.2.5 血清一氧化氮（NO）的測定

2.2.5.1 原理

NO化學性質活潑，在體內代謝很快轉為NO2-和NO3-，而NO2-又進一步轉化為NO3-，本法利用硝酸還原酶特異性將NO3-還原為NO2-，通過顯色深淺測定其濃度的高低。

2.2.5.2 操作

取2.2.3項的血清樣品按照一氧化氮試劑盒說明操作。具體操作見表2。

混勻，37℃準確水浴60 min。

試劑三(mL)0.20.20.2 試劑四(mL)0.10.10.1

混勻后放置30 s，4000 rpm/min，離心15 min，取澄清的上清液。

上清液(mL）0.50.50.5 顯色劑(mL)0.60.60.6

2.2.5.3 計算公式

血清中NO含量=（測定OD值-對照OD值）/(標準OD值-空白OD值)*標準品濃度*樣本測試前稀釋倍數(shù)。

2.2.6 統(tǒng)計學分析

3 實驗結果

3.1 對角叉菜膠致炎癥模型小鼠的足腫脹影響

由表3可知，與模型對照組比較，生理鹽水組、地塞米松組及各個劑量配伍組足腫脹度均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義（< 0.05）。與劑量配伍4組比較，劑量配伍2組足腫脹度降低，差異有統(tǒng)計學意義（< 0.05）。

表3 四個劑量比例瀉心湯水提物對小鼠足腫脹的影響（, n =10）

注：與模型對照組比較，*< 0.05；與劑量配伍4比較，#< 0.05

3.2 對角叉菜膠致炎癥模型小鼠的MDA、NO含量的影響

由表4可知，與模型對照組比較，生理鹽水組、地塞米松組及各個劑量配伍組MDA、NO含量均低于模型對照組組，差異有統(tǒng)計學意義（< 0.05）。與劑量配伍4組比較，劑量配伍2組MDA、NO含量均有明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（< 0.05）。

表4 四個劑量比例瀉心湯水提物對小鼠MDA、NO的影響（, n =10）

注：與模型對照組比較，*< 0.05；與劑量配伍4比較，#< 0.05

4 討論

小鼠足腫脹炎癥模型中角叉菜膠致炎癥反應是實驗中常用的經典模型，常用于藥物抗炎藥效的篩查與評估。小鼠炎癥的產生是對具備血管體系的活體組織在致炎作用下，經由炎癥介質介入激發(fā)的一系列病理過程，它是機體的防御反應。本試驗建立的角叉菜膠致炎癥模型主要是以機體毛細血管擴張，通透性增加導致炎性因子滲出和腫脹的早期反應。一氧化氮作為一種炎性介質，能激發(fā)組織的損害。炎癥產生過程當中同時伴隨大量氧自由基的生成，如醛基（MDA），測定炎性組織中MDA的量?？煞磻獧C體內脂質過氧化的程度。

本試驗采用角叉菜膠致小鼠足腫脹炎癥模型，通過稱量炎癥足及其非炎癥足的總量計算腫脹度以及測定血清MDA和NO含量，研究瀉心湯不同劑量配伍的抗炎活性。實驗結果顯示，瀉心湯不同劑量配伍抑制角叉菜膠致小鼠足腫脹的程度不同，降低小鼠炎性組織丙二醛（MDA）含量和一氧化氮（NO）含量也不同，也即瀉心湯不同劑量配伍，其抗炎作用程度不同。研究數(shù)據顯示藥物各成分的濃度比值發(fā)生變化，可能是造成中藥配伍的藥理活性改變之一，實驗結果為其進一步研究提供實驗依據。

生理鹽水組、地塞米松組及各個劑量配伍組MDA和NO含量以及足腫脹度均低于模型對照組組，說明地塞米松和瀉心湯都具有抗炎作用且有差異。固定大黃在整方中的劑量不變，只改變其他兩味中藥的劑量，更便于比較黃芩和黃連的比例變化對瀉心湯抗炎的差異。大黃瀉火通肺瀉毒、引火下行，瀉心湯中黃芩瀉肺燥濕解毒，黃連瀉心清胃、燥濕解毒，可見，黃芩、黃連與大黃都對瀉心湯的瀉火解毒這一功效有重要影響。它可能是酸性成分之間（即大黃中酸性成分與黃芩中黃酮酸性成分）相互作用，堿性成分之間（即黃芩中黃酮酸性成分和黃連中堿性成分）的相互作用的原因。

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COMPARATIVE STUDY OF XIEXIN DECOCTION WITH DIFFERENT-DOSE HERBS ON ANTI-INFLAMMATORY EFFECTS

WEI Jiang-cun1,2, QIN Zu-jie1, XIE Zhen2,*CHEN Yong2, PAN Zhen-zhen2, QIU Mei-yan1, ZHANG Xin2, QUE Zu-liang2

(1. Zhuangyao Pharmaceutical Research and Development Center, Guangxi International Zhuang Medical Hospital, Nanning, Guangxi 530201, China; 2. Scientific Experimental Center of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning, Guangxi 530201, China)

To compare the anti-inflammatory effects of Xiexin Decoction with different doses of compatibility and its anti-inflammatory effects.Carrageenan was used to induce the inflammation model in mice. The mice were oral administrated with Xiexin Decoction with different doses for 5 days, then the swelling degree of the feet was measured. the content of malondialdehyde (MDA) and Nitric oxide (NO) were determined by the test to investigate the anti-inflammatory activity.Compared with the model control group, the foot swelling degree of saline group, dexamethasone group and dose compatibility groups was significantly lower (< 0.05), and compared with dose compatibility group 4, the foot swelling degree of dose compatibility group 2 significantly decreased (<0.05). Compared with the model control group, MDA and NO contents in saline group, dexamethasone group and dose compatibility groups were significantly lower than those in model control group (< 0.05); compared with the dose compatibility group 4, NO and MDA contents in dose compatibility group 2 were significantly decreased (< 0.05).The Sanhuang Xiexin Decoctions with different contents have different anti-inflammatory effects.

Xiexin Decoction;dose compatibility;anti-inflammatory

1674-8085(2019)03-0097-02

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.03.018

2019-01-02；

2019-03-27

國家自然科學基金項目（81360524，81660701）；廣西自然科學基金項目（2016GXNSFAA380148，2014GXNSFAA118208）；廣西中醫(yī)藥大學2018年廣西一流學科建設項目重點課題（2018XK060）；千金藤啶堿成分藥材資源的篩選與開發(fā)（H14002）；廣西中藥藥效研究重點實驗室（17-259-20）；廣西高校中藥提取純化與質量分析重點實驗室（桂教科研〔2014〕6號）；國家中醫(yī)藥管理局科研三級實驗室中（壯）藥化學與質量分析實驗室（國中醫(yī)藥發(fā)2009[21]號）

魏江存(1989-)，男，廣西賀州人，藥師，碩士，主要從事中藥、民族藥質量分析及其藥效機制研究(E-mail: WJC2553@163.com);

秦祖杰(1966-)，男，廣西靈川人，教授，碩士，碩士生導師，主要從事民族藥學及中醫(yī)內科學研究(E-mail:109741754@ qq.com);

謝 臻(1979-)，男，廣西玉林人，副教授，博士，主要從事中藥質量控制及復方配伍研究(E-mail: xie_zhen@126.com);

*陳 勇(1961-)，男，江西南昌人，教授，碩士生導師，主要從事中藥及其制劑質量分析研究(E-mail:cy6381@163.com);

潘真真(1990-)，女，廣西桂林人，助教，主要從事中藥學專業(yè)研究(E-mail:413702890@qq.com);

邱美雁(1986-)，女，廣西桂平人，主管中藥師，主要從事中藥學相關研究(E-mail:326577249);

張 昕(1991-)，女，廣西柳州人，藥師，碩士，主要從事中藥學專業(yè)研究(E-mail:1427984865@qq.com);

闕祖亮(1991-)，男，廣西南寧人，碩士生，主要從事中藥學專業(yè)研究(E-mail:244366797@qq.com).