辣木根際土壤溶磷菌的篩選與鑒定

鄧 征，沈麗娟，饒 筱，張晶晶，何 茜，陳祖靜

（華南農業(yè)大學林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】辣木（Moringa oleifera Lam.）屬辣木科（Moringaceae） 辣木屬（Moringa Adans.），是多年生常綠或落葉小喬木，具有速生、豐產、抗逆性強、營養(yǎng)成分豐富及藥用價值高等特點，已成為工業(yè)、醫(yī)藥及動物飼料等領域重要的新型資源樹種［1］。作為速生樹種，辣木生長期需大量養(yǎng)分，生產上需進行多次施肥，但化肥的過量施入又常帶來嚴重的環(huán)境污染問題［2-3］?！厩叭搜芯窟M展】近年來，前人通過篩選與鑒定出具有溶磷作用的微生物來制作高效溶磷菌菌肥，這已成為目前微生物學、農林學、土壤學領域的研究熱點之一。研究表明，植物對土壤中的大部分無機磷和有機磷不能直接利用，植物吸收磷量與其產量和生物量存在顯著的正相關性，而大部分磷肥都作為無效態(tài)在土壤中積累［4］。土壤中有效磷含量高低是制約樹木生長的重要原因，土壤中含磷量雖高，但有效磷僅占土壤全磷含量的2%～3%，華南地區(qū)酸性土壤中嚴重缺磷，土壤中有效磷濃度遠遠低于10 mg/kg，已成為限制該地區(qū)經濟林木生產力的主要因素［5-6］。溶磷菌通過分泌的磷酸酶和有機酸起溶磷作用從而促進植物對磷的吸收［7］。土壤中的溶磷微生物不僅是通過自身分泌產物促進植物生長，還有些溶磷微生物互相作用對其他病原菌產生拮抗作用，并且溶磷微生物菌劑和化學肥料結合施用還有助于提高微生物種群密度，改善土壤微生態(tài)環(huán)境［8］。施用溶磷菌可將難溶性磷轉化為可溶性磷，進而促進植物的生長發(fā)育，提高化肥的利用效率［9］。因此，篩選和鑒定溶磷菌對未來使用綠色菌肥以提高植物生產力具有重大的意義。目前，國內外對溶磷菌的篩選和研究主要集中在農作物和蔬菜上，如油菜、辣椒、大蔥、水稻和大豆等，辣木溶磷菌菌株資源非常缺乏［10-12］。【本研究切入點】以辣木根際土壤為研究對象，通過透明溶磷圈法篩選和鉬銻抗比色法測定，并結合菌落形態(tài)特征及16S rDNA高通量測序鑒定優(yōu)勢溶磷菌?！緮M解決的關鍵問題】從辣木根際土壤中分離、篩選和鑒定溶磷細菌，為開發(fā)和應用高效溶磷菌菌肥、改善辣木林地土壤微生態(tài)環(huán)境以提高辣木生產力，提供優(yōu)質的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年4月，在華南農業(yè)大學辣木基地采集4年生健康辣木植株根際土壤。辣木分別引種自尼日尼亞（NY）、越南（YN）、印度（PM）、老撾（GY）、中國云南（M）5個地區(qū)。每個種源隨機選取8株辣木植株，樣品采集時先去除表層土，小心挖取0～20 cm土層的植株根系，離根表1 cm內的土為根際土壤，五點法隨機采集辣木的根際土。新鮮土壤樣品過孔徑0.100 mm篩后放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

分離培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基為蒙金娜無機磷固體培養(yǎng)基、蒙金娜有機磷固體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 LB 培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基為蒙金娜無機磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機磷培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶磷菌的分離 稱取新鮮土壤樣品10 g，放入裝有90 mL無菌水和含有小玻璃珠的250 mL三角瓶中，置于170 r/min搖床上振蕩30 min，靜置 20～30 s后，以上清液分別稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6菌液。采用稀釋平板涂抹法分離溶磷菌，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d，觀察菌落生長情況，每個樣品3個重復。

1.2.2 溶磷菌的篩選 對分離的溶磷菌進行平板初篩，挑取培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯溶磷圈或透明圈的菌落，接種在對應的蒙金娜有機和無機固體培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)3～12 d，得到單株具解磷能力的菌株。用十字交叉法測量溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），重復3次，計算透明圈與菌落直徑比。觀察記錄菌落的形狀、大小、邊緣結構、光澤、透明度、顏色等形態(tài)學指標。

1.2.3 溶磷能力測定 通過形態(tài)特征觀察及溶磷圈的比較，初步判斷各菌株的溶磷能力，進一步用鉬銻抗比色法測定其磷含量［13］，并用酸度計（上海三信儀器表廠，PHB-3型筆式pH計）測定其pH值。

1.2.4 分子生物學鑒定 用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化初篩的溶磷菌菌株，采用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根）提取 總DNA。 以16S rDNA通用引物（27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 1541R:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′） 對 優(yōu) 勢 菌株進行PCR擴增，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按PCR產物純化試劑盒（天根）的操作對PCR產物進行純化，并送至上海生工生物工程公司進行雙向測序。分析測序峰圖，對獲得的有效序列進行拼接，得到對應菌株的序列。同時，提取所有分離到的溶磷菌株DNA，等量混合后用引物Nobar_341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和 Nobar_805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）擴增 16S rDNA V3-V4區(qū)，并送至上海生工生物工程公司利用Illumina公司Miseq 2×250 bp平臺進行高通量測序，鑒定辣木根際土壤溶磷菌的種類和豐度。對高通量測序數據進行質檢、比對和拼接。在NCBI網站上用Blast工具對所得序列與GenBank等數據庫中的序列進行同源性比對分析，并用MEGA 5.0軟件包構建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定溶磷菌菌株，并參考《伯杰細菌鑒定手冊》對其進行描述。

試驗數據采用Excel和SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 溶磷菌平板初篩結果

辣木根際土壤中分別獲得19株解有機磷菌株和10株解無機磷菌株，透明圈與菌落直徑之比分別為1.2～2.5、1.3～1.9（圖1）。其中，有機菌株GY5的透明圈最大，與菌落直徑之比達到2.5，且溶磷圈隨著培養(yǎng)時間的延長而逐步增大。無機菌株PM5和GY7的透明圈最大，與菌落直徑之比達到1.9。從整體的情況來看，不同種源辣木土壤樣本篩選的溶磷菌數量和解磷能力各不相同，其中種源地為中國云南的辣木根際土壤分離出來的有機溶磷菌株最多且溶磷能力普遍較強，這可能是該品種引種馴化時間較長，其根際土壤溶磷細菌溶磷能力增加，以適應華南地區(qū)普遍缺磷的立地條件。尼日尼亞種源地中分離出來的無機溶磷菌株最多，但無機培養(yǎng)基中分離到的溶磷菌不同種源間無顯著差異。

圖1 辣木根際土壤部分有機、無機溶磷菌培育12 d的形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characteristics of partial organic and inorganic phosphorus-dissolving bacteria from rhizosphere soil of Moringa oleifera Lam. cultured for 12 days on Monkina medium

2.2 溶磷菌的菌落特征

對辣木根際土壤中所分離純化的29株溶磷菌菌落形態(tài)進行觀察，結果（表1、表2）顯示，溶磷能力較強的19株有機磷細菌中，大部分細菌菌落呈藍色、形狀不規(guī)則、光滑粘稠、不透明、扁平；溶磷能力較強的10株無機磷細菌中，大部分細菌菌落呈黃色、形狀不規(guī)則、光滑粘稠、不透明、扁平。

表1 有機溶磷菌培養(yǎng)12 d的菌落特征Table 1 Colony characteristics of organic phosphorusdissolving bacteria cultured for 12 days

表2 無機溶磷菌培養(yǎng)12 d的菌落特征Table 2 Colony characteristics of inorganic phosphorusdissolving bacteria cultured for 12 days

2.3 溶磷菌的溶磷能力

2.3.1 溶解有機磷的能力 利用鉬銻抗比色法對初篩溶磷菌株的溶磷能力進行測定，結果（圖2A）顯示，19個有機磷菌株都具有分解有機磷的能力，不同菌株間溶磷量差異較大，溶磷量為6.99～26.95 mg/L，M8菌株溶磷量最高，其溶磷量是溶磷能力最低菌株NY4的3.9倍。此外，各溶磷菌偏酸性，pH值為4.00～5. 83。

2.3.2 溶解無機磷的能力 試驗結果（圖2B）表明，10株無機溶磷菌均具有一定分解無機磷的能力， pH值為4.07～5.23，溶磷量為3.47～13.48 mg/L。與對照相比，接種溶磷菌后，各菌株培養(yǎng)液的pH均有不同程度的下降。此外，有機、無機溶磷菌培養(yǎng)液的溶磷量與pH之間基本表現(xiàn)為負相關關系，但相關性不顯著。

圖2 有機（A）、無機溶磷菌溶磷量（B）與 pH的相關性Fig. 2 Correlation between the amount of organic(A) and inorganic phosphorus-dissolving bacteria(B) and pH

2.4 16S rDNA高通量測序鑒定溶磷菌

利用高通量16S rDNA高通量測序鑒定所分離到的辣木根際土壤溶磷菌，分離到的溶磷菌有類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、貪銅菌屬（Cupriavidus）、桿菌屬（Bacillus）、細桿菌屬（Microbacterium）、根瘤菌屬 （Mesorhizobium）、根瘤菌（Bradurhizobium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和硝化桿菌屬（Bosea）等，其中類芽孢桿菌屬豐度最高、占50.51%，其次為貪銅菌屬和桿菌屬，分別占25.72%和18.19%。

結合形態(tài)學和分子生物學方法對溶磷能力較強的4株優(yōu)勢菌株進行鑒定，結果（圖3）表明，有機磷菌株NY6、SA2分別為蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，無機磷菌株YN7、M1分別為為巨大芽孢桿菌和假單胞菌，同源性均達到100%。

圖3 辣木根際土壤4株優(yōu)勢溶磷菌菌株序列鑒定Fig. 3 Identification of four dominant strains of phosphorus-solubilizing bacteria in rhizosphere soil of Moringa oleifera Lam. through sequencing

3 討論

不同植物根際土壤分離到的溶磷菌種類及溶磷能力均有差異［14］。本研究從辣木根際土壤中分離到的代表性無機磷溶磷細菌NY13和SA3的溶磷量分別為13.48、11.64 mg/L，低于杉木和玉米根際土壤中分離出溶磷菌的溶磷量，有機磷菌株M8的溶磷量為26.95 mg/L，高于玉米根際土壤中分離的代表性有機磷溶磷菌RYJ1-6菌株的溶磷量［15-16］?？傮w來看，從辣木根際分離得到無機溶磷細菌的溶磷能力普遍低于玉米等其他植物，而根際有機溶磷細菌的溶磷能力高于玉米等植物，這可能與辣木的根系特性相關。

pH會影響溶磷菌的溶磷量，這可能與不同菌株的溶磷機制相關。溶磷菌的溶磷機理比較復雜，有的溶磷菌是通過釋放質子，降低土壤pH來起作用，有的是通過分泌有機酸起作用，有的則是通過分泌磷酸酶來溶磷，還有些溶磷菌是多種機制并存綜合作用［17-18］。Illmer等［19］研究表明培養(yǎng)基的pH與溶磷量并沒有相關性，這種差異可能與溶磷菌本身的特性有關。本研究中辣木根際土壤無機溶磷菌的溶磷量與其培養(yǎng)基pH之間呈一定的負相關，但相關性不顯著，而有機溶磷菌的溶磷量與其培養(yǎng)基pH之間無相關性。

辣木根際土壤篩選鑒定的優(yōu)勢無機溶磷菌巨大芽孢桿菌和假單胞菌目前在植物上應用比較廣泛。其中巨大芽孢桿菌YN7菌株和蠟樣芽孢桿菌NY6菌株的pH值分別為4.07和4.83，這與這兩類菌能產生有機酸的結果吻合，其溶磷機制可能是通過分泌有機酸和磷酸酶來溶磷，堿性磷酸酶是有機磷溶解的主要機制，而酸類物質促進了難溶性含磷物的溶解，是磷的主要溶解機制［20-21］。目前，優(yōu)勢溶磷菌枯草芽孢桿菌SA2菌株和假單胞菌M1菌株在食品及飼料方面研究眾多，枯草芽孢桿菌易溶解磷礦粉，促進植物生長，而假單胞菌具有溶解磷酸三鈣的能力，受氮源影響較大。目前，對類芽孢桿菌屬的溶磷機理相關研究很少，但對其進行蛋白質組學研究時，發(fā)現(xiàn)其溶磷過程有磷酸基團進入菌體參與糖酵解、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)以及電子傳遞和氧化磷酸化等過程，具有一定借鑒作用［22］。在細菌拮抗與菌肥應用試驗中，枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌相互間不存在拮抗現(xiàn)象，這幾種菌均有相對較顯著的解磷作用，較適合應用于菌肥生產［23］。

4 結論

本研究共分離到辣木根際土壤溶磷菌29株菌株，主要為類芽孢桿菌屬、貪銅菌屬、桿菌屬、細桿菌屬、根瘤菌屬和根瘤菌等，各菌株溶磷能力與其培養(yǎng)基pH之間有一定相關性，但相關性不顯著。優(yōu)勢磷菌株NY6、SA2、YN7、M1分別為巨大芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌及假單胞菌，可作為栽培辣木溶磷菌肥的候選菌株資源。