響應面法優(yōu)化羅漢松總二萜提取及抗氧化研究

袁堂豐，瞿利民，郭 婕，2

（1.吉首大學林產化工加工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000；2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410428）

羅漢松Podocarpus macrophyllus (Thunb.) D.Don 是羅漢松科Podocarpaceae 羅漢松屬Podocarpus 常綠喬木植物，主要分布在我國江南各省及臺灣地區(qū)[1]。該植物有多種藥用價值，其根皮有活血止痛、治療跌打損傷的療效；其葉子能治療風濕；其種子有補血益氣、補腎益肺的功效[2]關于羅漢松的研究，目前主要集中在遺傳多樣性及快速繁殖技術。近年來，隨著植物藥用成分分離技術水平的提高，國內外學者對羅漢松及其同屬其它植物的化學成分和生物活性研究漸多，化學成分類型涉及二萜、二萜內酯以及雙黃酮等成分[3-6]，生物活性研究表明這些化合物具有不同程度的殺蟲、昆蟲拒食、抑菌、抗氧化及抗腫瘤等活性[7-11]。

本文前期對羅漢松屬植物的二萜成分做了大量調研和總結，發(fā)現(xiàn)其二萜類骨架主要有松香烷型和桃拓烷型，這些二萜表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗氧化和抗炎等活性[5]，結構上具有多取代苯環(huán)的苯基型二萜的特征[12]，有相似的分子結構式和發(fā)色團，所以這類二萜化合物在同一波長處具有相似的紫外吸收特征和相同的吸收系數(shù)，都存在兩個主要的吸收帶：峰帶Ⅰ（210～220 nm）和峰帶Ⅱ（270～280 nm）。目前有關羅漢松中總二萜含量測定和提取工藝尚未見報道。因此本文選擇以桃拓酚為對照品，采用紫外分光光度法測定羅漢松提取物的總二萜含量，并通過響應面法對羅漢松總二萜提取工藝進行優(yōu)化，建立簡便、穩(wěn)定、可靠的總二萜檢測方法，同時也為其它羅漢松屬植物總二萜含量的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

樣品于2017年8月采自湖南省張家界市錦程園藝公司，經吉首大學谷伏安副教授鑒定為羅漢松科植物羅漢松。

桃拓酚標準品購自云南昆明西力生物科技有限公司；無水甲醇、乙酸乙酯、石油醚均為國產分析純試劑；實驗用水均為超純水。

Thermo Evolution 220 紫外可見分光光度計；IKA RV 10 Digital V 旋轉蒸發(fā)儀；XO-5200DT 超聲清洗機；平凡TD5A 臺式低速離心機；GZX-9146MBE 型數(shù)顯鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；AEL-40SM 型十萬分之一電子天平；AEG-220 型萬分之一天平（日本SHIMADZU）。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅漢松總二萜的測定

1.2.1.1 羅漢松總二萜提取

將羅漢松放入鼓風干燥箱50℃干燥72 h，用粉碎機粉碎后過80 目篩子。取5 g 羅漢松粉末，分別按不同的提取溫度，甲醇濃度和液料比，超聲提取若干次，每次若干分鐘，然后5 000 r/min離心5 min，合并上清液，旋蒸除去溶劑得浸膏。將浸膏懸于200 mL 超純水中先用石油醚萃取除去脂類，再用乙酸乙酯萃取3 次，每次100 mL，收集合并上層液，旋蒸除去乙酸乙酯，然后用無水甲醇定容至100 mL，得到羅漢松提取液。準確量取1 mL 羅漢松提取液置于50 mL 容量瓶中，用無水甲醇定容至刻度備用。

1.2.1.2 標準溶液的制備準確稱取6.10 mg 桃拓酚對照品于25 mL 容量瓶中，無水甲醇定容至刻度，搖勻，配得濃度為0.244 mg/mL 的對照品儲備液。分別量取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL 置 于10 mL 容量瓶中用無水甲醇定容至刻度，分別得到濃度為0.024 4、0.048 8、0.073 2、0.097 6、0.122 0、0.146 4 mg/mL 的系列桃拓酚標準液。

1.2.1.3 測定波長的選擇

取濃度為0.073 2 mg/mL 桃拓酚標準液，以無水甲醇為空白對照，在200～800 nm 范圍內掃描，確定其最大吸收波長為278 nm，見圖1。

圖1 紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectra

1.2.1.4 標準曲線的繪制

取上述系列濃度標準品溶液，以無水甲醇作為空白對照，在278 nm 處測定吸光度A。以測定的吸光度A 為縱坐標，溶液濃度C 為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：A=0.007 4C+0.002 3，R2=0.999 8，結果表明桃拓酚標準液在0.024 4～0.146 4 mg/mL范圍內吸光度與濃度呈良好線性關系。

1.2.1.5 總二萜含量測定

量取適量的樣品溶液，以無水甲醇為空白對照，于278 nm波長下測定其吸光度，帶入回歸方程，求出樣品溶液中總二萜質量濃度。

1.2.2 羅漢松總二萜提取條件單因素試驗設計

以提取溫度、甲醇濃度、液料比、提取次數(shù)、提取時間為影響因素，研究不同水平下各因素對羅漢松總二萜得率的影響。

總二萜得率=(CV/M)×100%。

式中：C 為提取液濃度，g/mL；V 為提取液體積，mL；M 為羅漢松粉末質量，g。

1.2.3 響應面法分析試驗[13]

在單因素試驗基礎上，選擇提取溫度、甲醇濃度、和液料比為考察因素，以總二萜得率設計響應面因素水平表，見表1。

1.2.4 方法學試驗

按照1.2.1.1 的方法，參照響應面優(yōu)化后的工藝條件制備樣品，按照1.2.1.5 的方法進行精密度、重復性、穩(wěn)定性、回收率等方法學驗證試驗。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.2.5 羅漢松總二萜的抗氧化活性試驗

1.2.5.1 DPPH 自由基清除活性測定

分別取2.0 mL 不同質量濃度的樣品溶液，加入0.2 mmol/L DPPH 甲醇溶液2.0 mL，搖勻，室溫下避光30 min，以無水甲醇作對照，于517 nm處測定吸光度A1。對照組以無水甲醇代替DPPH甲醇溶液，測定其吸光度A2?？瞻捉M以無水甲醇代替樣品溶液，測定其吸光度A0。以相應質量濃度的Vc 作陽性對照，按公式(1)計算出DPPH 自由基的清除率，考察羅漢松總二萜清除DPPH 自由基能力的強弱。每組做3 次平行試驗，取平均值。

式中：A0為空白組的吸光度；A1為樣品組的吸光度；A2為對照組的吸光度。

1.2.5.2 羥自由基清除活性測定

羅漢松二萜對羥自由基的清除作用參照文獻[14]稍作修改，在10 mL 的具塞試管中依次加入9.0 mmol/L 的FeSO4溶 液2.0 mL，8.8 mmol/L 的H2O2溶液2.0 mL，9.0 mmol/L 的水楊酸-甲醇溶液2.0 mL，最后分別加入不同質量濃度的樣品溶液2.0 mL，37 ℃恒溫水浴加熱15 min 后，在510 nm波長下測其吸光度A0′，對照組以無水甲醇代替水楊酸-甲醇溶液，測定其吸光度A2′，空白組以無水甲醇代替樣品溶液，測定其吸光度A0′。以相應質量濃度的Vc 作陽性對照，按下列公式（2）計算出樣品對羥自由基的清除率Y′，考察羅漢松總二萜清除羥自由基能力的強弱。每組做3 次平行試驗，取平均值。

式中：A0′為空白組的吸光度；A1′為樣品組的吸光度；A2′為對照組的吸光度。

1.2.5.3 超氧陰離子自由基清除活性測定，

采用鄰苯三酚自氧化法，配置1 mL 不同質量濃度的樣品，分別加入4.5 mL pH 為8.2，濃度為50.0 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液，并置于25 ℃水浴鍋中20 min，然后加入25 ℃預熱過的7.0 mmol/mL鄰苯三酚0.2 mL，混合均勻后反應4 min，最后用0.5 mL 濃鹽酸終止反應。以超純水為參比溶液，于320 nm 處測定吸光度值A1″，空白組以Tris-HCl緩沖溶液代替樣品溶液測定吸光度值A0″，對照組以Tris-HCl 緩沖溶液代替鄰苯三酚鹽酸溶液，測定吸光度值A2″。根據(jù)公式（3）計算出樣品羥自由基的清除率Y″，考察羅漢松總二萜清除超氧陰離子能力的強弱。每組做3 次平行試驗，取平均值。

式中：A0″為空白組的吸光度；A1″為樣品組的吸光度；A2″為對照組的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 提取次數(shù)的影響

按照1.2.1.1 的方法制備樣品，在液料比為30∶1(mL/g)，甲醇濃度為80%，提取溫度為50 ℃，每次提取時間30 min 的條件下考察不同提取次數(shù)（2、3、4、5 次）對羅漢松總二萜得率的影響，所有單因素試重復3 次，取其平均值，結果見圖2a。由圖2a可知，當提取次數(shù)超過3 次時總二萜得率沒有明顯變化，同時在懸蒸時發(fā)現(xiàn)，濃縮后浸膏質量不在有所增加，證明提取3 次已經能夠將羅漢松中大部分二萜類成分提取出來，從節(jié)約試劑的角度考慮，將提取次數(shù)固定為三次。

2.1.2 提取時間的影響

按照1.2.1.1 的方法制備樣品，在液料比為30∶1 (mL/g)，甲醇濃度為80%，提取溫度為50 ℃，提取次數(shù)為3 次的條件下考察不同提取時間（15、20、25、30、35 min）對羅漢松總二萜得率的影響，結果見圖2b。由圖2b可知，提取時間超過20 min后，總二萜得率基本不變，為提高工作效率，將提取時間固定為20 min。

2.1.3 提取溫度的影響

按照1.2.1.1 的方法制備樣品，在液料比為30∶1(mL/g)，甲醇濃度為80%，提取次數(shù)3 次，每次20 min 的條件下考察不同提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）對羅漢松總二萜得率的影響，結果見圖2c。由圖2c可知，隨著溫度的升高，總二萜得率逐漸增大，當溫度為60 ℃最為適宜，繼續(xù)升高溫度，二萜得率反而變小，可能是高溫造成部分二萜發(fā)生降解。因此選取50、60、70 ℃這3 個水平進行響應面試驗。

2.1.4 甲醇濃度的影響

按照1.2.1.1 的方法制備樣品，在提取溫度為60 ℃，液料比為30∶1(mL/g)，提取次數(shù)3 次，每次20 min 的條件下考察不同甲醇濃度（60%、70%、80%、90%和100%）對羅漢松總二萜得率的影響，結果見圖2d。由圖2d 可知，當甲醇濃度從60%升高至80%時，總二萜得率明顯增加，繼續(xù)提高甲醇濃度，又開始變小，這可能是由于甲醇的滲透能力較強，提高甲醇濃度能加速目標成分在提取液和細胞質基質之間的溶解平衡。因此選取70%、80%和90%這3個水平進行響應面試驗。

圖2 提取次數(shù)(a)、提取時間(b)、提取溫度(c)、甲醇濃度(d)、液料比(e)對總二萜得率的影響Fig.2 Effect of extraction times (a),extraction time (b),extraction temperature (c),methanol concentration (d),liquid-solid ratio (e) on the yield of diterpenoids

2.1.5 液料比的影響

按照1.2.1.1 的方法制備樣品，在提取溫度為60 ℃，甲醇濃度為80%，提取次數(shù)3 次，每次20 min 的條件下考察不同液料比（20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）(mL/g)對羅漢松總二萜得率的影響，結果見圖2e。由圖2e 可知隨著液料比逐漸增大，總二萜得率顯著增加，繼續(xù)增大液料比，二萜得率基本保持不變。因此，為了滿足較高的得率和節(jié)約溶劑損耗兩方面因素，同時考慮到濃縮回收的工作量，這里我們選擇20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)這3 個水平進行響應面試驗。

2.2 響應面分析優(yōu)化工藝

2.2.1 響應面回歸模型的方差分析

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken 設計法，對羅漢松總二萜進行三因素三水平優(yōu)化試驗設計，結果見表2。

應用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對將所得的實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得多元二次回歸方程Y=1.12+0.078A+0.031B+0.069C-0.020AB+0.005AC- 0.033BC-0.150A2-0.150B2-0.100C2方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗設計及結果 Table 2 Effect design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Variance analysis of regression model

由 表3可 知，該 模 型F=42.10，P ＜0.001，表明該模型高度顯著，方差分析結果F=3.32，P=0.1386，表明該模型失擬不顯著。模型充分擬合試驗數(shù)據(jù)，其響應值得率變化與所選變量提取溫度(A)、甲醇濃度(B)、液料比(C)高度相關，擬合程度良好，試驗誤差小，可用此模型對提取羅漢松總二萜的得率進行分析和預測。模擬回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗如下：一次項A，C，二次項A2，B2，C2對總二萜得率的影響是極其顯著的，一次項C 對總二萜得率的影響是顯著的。各因素對總二萜得率的影響的大小順序為提取溫度＞液料比＞甲醇濃度。

2.2.2 響應面圖分析

在回歸模型分析的基礎上，運用Design-export 8.0.6.1 軟件繪制三維響應面圖（圖3）可更直觀地反映交互因素對羅漢松總二萜得率的影響。等高線的形狀可以反映交互相的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用明顯，而圓形則與之相反[15-16]。圖3a和3c顯示曲面較為陡峭、等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明提取溫度和甲醇濃度、液料比和甲醇濃度的交互作用對羅漢松總二萜得率的影響比較明顯；圖3b等高線趨近于圓形，說明提取溫度和液料比交互作用不明顯。

圖3 不同因素對羅漢松總二萜得率的影響Fig.3 Response surface plots illustrating the mutual effects of factors on the yield of diterpenoids

再對回歸模型進行進一步典型性分析，得到最佳提取工藝條件為提取溫度為62.68 ℃、甲醇濃度80.46%、液料比26.34（mL/g），預測值為1.140 2%。為方便操作，將最優(yōu)方案定為提取溫度63.00 ℃、甲醇濃度80.00%、液料比26.00∶1（mL/g）。按最優(yōu)方案中的條件進行驗證試驗，平行試驗3 次，試驗結果分別為1.14%、1.13%、和1.12%，取平均值 1.13%（RSD=0.89%）。驗證試驗結果與模型預測十分接近，表明試驗擬合程度好，試驗誤差小，因此基于響應面法分析得到的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準確可靠，具有使用價值。

2.3 測定方法評價

2.3.1 精密度試驗

取濃度為0.073 2 mg/mL 桃拓酚標準液，以無水甲醇為空白對照，按照1.2.1.5 的方法，連續(xù)測定6 次，記錄數(shù)據(jù)，計算其RSD 值為0.2%，表明精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

按照1.2.1.1 的方法，參照響應面優(yōu)化后的工藝條件制備樣品，按照1.2.1.5 的方法，連續(xù)測定6 次，記錄數(shù)據(jù)如表4，計算其RSD 值，結果見表4。由表4可知，該標準偏差為0.000 8，RSD 值為0.193 3%，呈現(xiàn)出良好的重復性。

表4 重復性試驗Table 4 Repeatability tests of the determination results

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

按照1.2.1.1 的方法，參照響應面優(yōu)化后的工藝條件制備樣品，按照1.2.1.5 的方法，在120 min內定時測量其吸光度，記錄數(shù)據(jù)，計算其RSD 值，結果見表5。由表5可知標準偏差為0.001 0，RSD值為0.235 3%，表明樣品在2h 內檢測穩(wěn)定。

2.3.4 回收率試驗

按照1.2.1.1 的方法，參照響應面優(yōu)化后的工藝條件制備樣品，分別量取10 mL 樣品溶液，共6 份，每份加入1.2 mg 桃拓酚對照品，充分溶解，按照1.2.1.5 的方法，分別測定其吸光度，記錄數(shù)據(jù)，并計算出混合后的總二萜含量以及RSD 值，結果見表6。由表6可知，RSD 值為0.266 5%，具有較高的回收率99.67%。

表5 穩(wěn)定性試驗Table 5 Stability tests of the determination results

表6 回收率試驗(n = 6)Table 6 Recovery tests of gallic acid (n = 6)

2.4 抗氧化活性測定

2.4.1 羅漢松總二萜清除DPPH 自由基能力

根據(jù)1.2.5.1的方法分別計算出羅漢松總二萜、Vc 對DPPH 自由基清除率，得到兩種抗氧化劑的清除曲線，如圖4所示。

圖4 DPPH 自由基清除能力曲線Fig.4 Curve of DPPH scavenging rate

由圖4可以看出，在試驗設計質量濃度范圍內，總二萜提取液對DPPH 自由基具有良好的清除能力，且清除能力隨著溶液質量濃度的增加而增強。當質量濃度為0.59 mg/mL 時，總二萜提取液對DPPH 自由基的清除率達到了81.71%，而在試驗設計質量濃度范圍內，Vc 清除DPPH 自由基的能力始終強于總二萜提取液。通過擬合曲線計算總二萜提取物清除DPPH 自由基的IC50為0.28 mg/mL。

2.4.2 羅漢松總二萜清除羥自由基能力

根據(jù)1.2.5.2的方法分別計算出羅漢松總二萜、Vc 對羥自由基的清除率，得到兩種抗氧化劑的清除曲線，如圖5所示。

圖5 羥自由基清除能力曲線Fig.5 Curve of hydroxyl free radical scavenging capacity

由圖5可以看出，在試驗設計質量濃度范圍內，總二萜提取液對羥自由基的清除能力隨著質量濃度的增加而增強，存在明顯的量效關系。當質量濃度為0.59 mg/mL 時，總二萜提取液和Vc 對羥自由基的清除率分別為66.27%、98.87%，通過擬合曲線計算出兩者的IC50分別為0.37 mg/mL、0.12 mg/mL。與Vc 相比，總二萜提取液對羥自由基的清除能力較弱。

2.4.3 羅漢松總二萜清除超氧陰離子能力

根據(jù)1.2.5.3的方法分別計算出羅漢松總二萜、Vc 對超氧陰離子的清除率，得到兩種抗氧化劑的清除曲線，如圖6所示。

由圖6可以看出，在試驗設計質量濃度范圍內，總二萜提取液和Vc 對超氧陰離子具有不同程度的清除能力，且清除能力隨著質量濃度的增加而增強，存在量效關系。當質量濃度為0.59 mg/mL 時，總二萜提取液和Vc 對超氧陰離子的清除率分別為38.60%、97.13%，總二萜提取液對超氧陰離子的清除能力明顯弱于Vc，但仍有一定的清除活性。

圖6 超氧陰離子清除能力曲線Fig.6 Curve of superoxide anion radical scavenging capacity

3 結論與討論

本研究在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken 試驗設計原理，通過響應面分析法對羅漢松總二萜提取工藝進行優(yōu)化，通過分析試驗結果得到，影響羅漢松總二萜得率的因素主次順序為：提取溫度(A)＞液料比(C)＞甲醇濃度(B)，最佳提取條件為：提取次數(shù)3 次、每次20 min、提取溫度63.00 ℃、甲醇濃度80.00%、液料比26.00∶1(mL/g)，總二萜得率為1.13%，與預測值基本一致，說明該模型可靠性較高，能很好的預測各因素與得率間的關系?？寡趸钚栽囼灲Y果表明，羅漢松總二萜對DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子3 種自由基具有不同程度的清除能力，當質量濃度達到0.59 mg/mL 時，清除率分別為81.71%、66.27%、38.60%，抗氧化活性較好。苯基二萜除了具有良好的抗氧化活性外，還有著顯著的抗腫瘤、抗病毒等活性[17]，極具開發(fā)價值。本研究已初步證明羅漢松總二萜提取物具有良好的抗氧化活性，但總二萜的其他生物活性及單體二萜的純化和生物活性有待進一步研究。