超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯

王咪咪 謝德芳

摘? 要? 建立了香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯多殘留分析方法。樣品經(jīng)1%乙酸乙腈提取，N-丙基乙二胺（PSA）和石墨化炭黑（GCB）凈化，以甲醇和2 mmol/L乙酸銨水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫分離，采用電噴霧正離子源模式 （ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）采集數(shù)據(jù)，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。吡蟲啉和高效氯氰菊酯在0.001～0.1 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r > 0.9991，方法檢出限（LOD）為1 pg，定量限（LOQ）為0.01 mg/kg。在0.01、0.05、0.10 mg/kg 3個(gè)添加水平下，吡蟲啉和高效氯氰菊酯在香蕉中的回收率為84.91%～104.78%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.23%～9.69%。該法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯的殘留量測(cè)定。

關(guān)鍵詞? 香蕉;吡蟲啉;高效氯氰菊酯;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中圖分類號(hào)? TQ453.6? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Abstract? A method was established for the simultaneous determination of imidacloprid and β-cypermethrin residues in bananas. The samples were extracted with 1% of acetic acid-acetonitrile， cleaned by PSA and GCB. Gradient elution separation was carried out with methanol and 2 mmol/L ammonium acetate solution as the mobile phase. The samples were determined using electrospray positive ionization （ESI+） with multiple reaction monitoring （MRM） and then quantified by the matrix-matched external standard method. The results showed that the correlation coefficient r was > 0.9991， when the concentration ranged from 0.001 to 0.1 mg/L. The limit of detection （LOD） was 1 pg and the limit of quantification （LOQ） was 0.01 mg/kg. The recovery of imidacloprid and β-cypermethrin in banana was from 84.91% to 104.78% and the relative standard deviation （RSD） was from 1.23% to 9.69%. The method is simple， sensitive and reproducible for the determination of imidacloprid and β-cypermethrin residues in bananas.

Keywords? banana; imidacloprid; β-cypermethrin; UPLC-MS/MS

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.020

吡蟲啉（imidacloprid）屬新煙堿類內(nèi)吸性殺蟲劑，具有高效、廣譜、低毒等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)蚜蟲、薊馬等害蟲有特效[1-2]。高效氯氰菊酯? 是擬除蟲菊酯類高效殺蟲劑中的一種，具有極高的胃毒和觸殺作用[3-4]。由于這2種農(nóng)藥殺蟲效果顯著，近年來被廣泛應(yīng)用于香蕉種植中。但在當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于管理水平不一、監(jiān)管不足，蕉農(nóng)質(zhì)量安全意識(shí)淡薄，擅自增加施藥次數(shù)和加大施藥劑量，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)增加。為了保證香蕉質(zhì)量安全，建立快速準(zhǔn)確測(cè)定香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯殘留的方法顯得尤為重要。

目前，已報(bào)道的吡蟲啉和高效氯氰菊酯的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[5-6]、高效液相色譜法[7]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[9]等，涉及的基質(zhì)有西紅柿、韭菜、水、蝦等。但是這些研究均為單一農(nóng)藥的測(cè)定方法，同時(shí)測(cè)定香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯的分析方法尚未見報(bào)道。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC- MS/MS）檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、檢出限低、抗干擾能力強(qiáng)和定性定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，使其成為香蕉中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的常用技術(shù)。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前處理方法因具有快速、簡(jiǎn)單、價(jià)廉、有效、實(shí)用、安全等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。本研究采用改進(jìn)的QuEChERS前處理技術(shù)，結(jié)合UPLC-MS/MS法建立了香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯同時(shí)測(cè)定的方法，以期為香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯的殘留檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 香蕉，采自?？谑谐芜~縣香蕉園，采收時(shí)7～8分熟。

標(biāo)準(zhǔn)品吡蟲啉（純度為99.8%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer）、高效氯氰菊酯（純度為99.1%，美國(guó)Cato Research Chemical Inc.）;甲醇、乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）;甲酸、乙酸、乙酸銨、氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純AR，廣州化學(xué)試劑廠）;N-丙基乙二胺（PSA，深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）、石墨化炭黑（GCB，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.1.2? 儀器與設(shè)備? AB 4000+超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，美國(guó)AB SCIEX公司;電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;多管渦旋混合器，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司;超純水儀，成都超純科技有限公司;IKAT25高速勻漿機(jī)，上海萬捷科技有限公司;落地式高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi Koki Co.， Ltd;氮吹儀，美國(guó)Organomation Associates Inc.。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品前處理? 準(zhǔn)確稱取10.0 g均質(zhì)良好的香蕉樣品于50 mL離心管中，加20 mL 1%乙酸乙腈，以12 000 r/min勻漿2 min，2500 r/min渦旋5 min，8000 r/min離心5 min;將全部上清液轉(zhuǎn)入已加有2.0 g氯化鈉的50 mL離心管中，2500 r/min渦旋5 min，8000 r/min離心5 min;取10 mL上清液轉(zhuǎn)入已加有PSA（200 mg）+GCB（100 mg）+無水硫酸鎂（800 mg）的15 mL離心管中，2500 r/min渦旋5 min，8000 r/min離心5 min，取1.5 mL上清液過0.22 ?m有機(jī)系濾膜后收集于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，待進(jìn)樣。

1.2.2? 檢測(cè)條件? （1）超高效液相色譜條件。色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 ?m，Waters公司）;柱溫：40 ℃;流動(dòng)相：A為2 mmol/L乙酸銨，B為甲醇;流速：0.25 mL/min;進(jìn)樣量：10 ?L;運(yùn)行時(shí)間：5 min。梯度洗脫程序：0～0.1 min，90%～40% A;0.1～ 1.5 min，40%～20% A;1.5～1.6 min，20%～10% A;1.6～4.0 min，10% A;4.0～4.1 min，10%～90% A;4.1～5.0 min，90% A。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧正離子電離源（ESI+）;掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）;離子源溫度：600 ℃;碰撞氣：6 psi;霧化器GS1：50 psi、GS2：50 psi;離子噴霧電壓：5500 V;氣簾氣：20 psi。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 檢測(cè)條件優(yōu)化

2.1.1? 質(zhì)譜條件優(yōu)化? 將1.00 ?g/mL的化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過質(zhì)譜儀注射泵以10 ?L/min的速度將其注入質(zhì)譜系統(tǒng)，在正離子模式下進(jìn)行母離子Q1 MS（Q1）掃描，確定分子離子峰，并對(duì)去簇電壓（DP）進(jìn)行優(yōu)化;以分子離子峰為母離子，進(jìn)行子離子Product Ion（MS2）掃描，通過逐漸加大碰撞能量，使離子不斷破碎，當(dāng)母離子峰高為子離子峰高的1/4～1/3時(shí)，停止增加碰撞能量。選擇離子峰度最強(qiáng)的為定量離子，選擇1～2個(gè)離子峰度較強(qiáng)的為定性離子，并對(duì)碰撞能量（CE）進(jìn)行優(yōu)化[10]。吡蟲啉和高效氯氰菊酯的質(zhì)譜條件見表1。

2.1.2? 色譜條件優(yōu)化? 采用Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 ?m），在流速為0.25 mL/min條件下，考察了乙腈-水、乙腈- 2 mmol/L乙酸銨水溶液、甲醇-水、甲醇-2 mmol/L乙酸銨水溶液4種流動(dòng)相體系對(duì)吡蟲啉和高效氯氰菊酯檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，以甲醇- 2 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)化合物離子化效率高、峰形良好、靈敏度高。在此檢測(cè)條件下，吡蟲啉的保留時(shí)間為0.96 min，高效氯氰菊酯的保留時(shí)間為2.90 min。

2.2? 樣品前處理

2.2.1? 提取溶劑的選擇? QuEChERS方法通常以乙腈為提取劑對(duì)樣品中的化合物進(jìn)行提取[11-12]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乙腈中加酸不但有利于改善峰形、提高靈敏度，而且還可以提高農(nóng)藥回收率[13-15]{！?。?INVALID CITATION ?。?！ {李菊穎`， 2017 `#81`;李俊芳`， 2016 `#84}，? #0;李俊芳， 2016 #84;蘇敏， 2011 #82}。本研究比較了乙腈、0.1%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈、0.1%乙酸乙腈、1%乙酸乙腈對(duì)香蕉全蕉和蕉肉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯的提取效果（表2）。研究結(jié)果表明，以乙腈、0.1%甲酸乙腈為提取劑時(shí)，吡蟲啉回收率較低，1%乙酸乙腈為提取劑時(shí)，吡蟲啉和高效氯氰菊酯的回收率較好，因而最終選擇1%乙酸乙腈作為提取劑。

2.2.2? 凈化劑的選擇? QuEChERS方法中常用的凈化劑有PSA、C18、GCB等[16-17]，其中PSA主要用于去除樣品中的糖類、有機(jī)酸、金屬離子等，C18用于去除樣品中的脂類和蛋白質(zhì)等成分，GCB對(duì)樣品中色素有較強(qiáng)的吸附凈化能力[18-19]。分別以香蕉全蕉和蕉肉為基質(zhì)，對(duì)凈化過程中不同凈化劑用量進(jìn)行優(yōu)化（表3）。結(jié)果表明，當(dāng)PSA用量為200 mg時(shí)，2種農(nóng)藥的回收率在93.09%～ 98.15%;隨著GCB用量的增加，提取液凈化效果逐漸提高，顏色逐漸變淺。當(dāng)GCB用量為100 mg時(shí)，吡蟲啉和高效氯氰菊酯的回收率在93.83%～ 99.62%。同時(shí)加入一定量無水硫酸鎂，用于去除提取液中殘留的少量水分。最終確定的凈化劑組合為PSA（200 mg）+GCB（100 mg）+無水硫酸鎂（800 mg）。

2.3? 方法的線性相關(guān)性、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

采用外標(biāo)法定量。將配制好的100 ?g/mL的吡蟲啉和高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇逐級(jí)稀釋制成0.001、0.01、0.02、0.05、0.1 ?g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。取適量濃度一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入2 mL容量瓶中，氮?dú)獯蹈?，按?.2.1中所述方法，對(duì)空白香蕉全蕉和果蕉肉樣品進(jìn)行處理，制得空白基質(zhì)溶液。用空白樣品基質(zhì)稀釋成0.001、0.01、0.02、0.05、0.1 ?g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.22 ?m有機(jī)膜，進(jìn)樣。以峰面積對(duì)進(jìn)樣濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（表4），結(jié)果表明，吡蟲啉和高效氯氰菊酯的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.001～ 0.1 ?g/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r > 0.9991）。

2.4? 方法的精密度和加標(biāo)回收率

稱取空白樣品加入一定量吡蟲啉、高效氯氰菊酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加濃度重復(fù)5次。按照1.2節(jié)所述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。吡蟲啉和高效氯氰菊酯在全蕉和蕉肉中的回收率為84.91%～104.78%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.23%～9.69%（表5）。該方法的準(zhǔn)確度和精密度符合農(nóng)藥殘留分析要求。

3? 討論

基質(zhì)效應(yīng)即樣品中其他組分對(duì)目標(biāo)化合物測(cè)定結(jié)果的影響，是UPLC-MS/MS檢測(cè)過程中影響方法精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度的主要原因[20]。本研究中，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液制作曲線對(duì)樣品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行定量，最大限度的減少了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來的影響。

QuEChERS是目前果蔬農(nóng)藥殘留分析中最常用的前處理方法，其原理是利用凈化劑與樣品中雜質(zhì)間的相互作用，吸附雜質(zhì)而達(dá)到凈化的目的。其主要操作步驟為：樣品經(jīng)乙腈提取，氯化鈉和無水硫酸鎂鹽析分層，PSA吸附凈化，過膜得待測(cè)液。本研究基于香蕉全蕉和蕉肉基質(zhì)對(duì)QuEChERS方法進(jìn)行優(yōu)化：首先，在提取劑中加入少量酸性溶液，結(jié)果表明農(nóng)藥的回收率顯著提高。李俊芳等[14]運(yùn)用該法測(cè)定蘋果中農(nóng)藥殘留時(shí)，發(fā)現(xiàn)1%乙酸乙腈為提取劑，農(nóng)藥的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均優(yōu)于原創(chuàng)方法（乙腈為提取劑）。主要是因?yàn)?%乙酸乙腈與加入的醋酸鹽形成醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，使得提取液pH控制在5左右，有利于農(nóng)藥的提取。其次，對(duì)凈化劑進(jìn)行選擇，并對(duì)其用量進(jìn)行優(yōu)化。凈化時(shí)加入一定量PSA和GCB，能有效去除樣品中糖類、有機(jī)酸、色素等成分，干擾物質(zhì)的去除有利于降低方法檢出限，提高試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度。

本研究建立了一種利用改進(jìn)的QuEChERS為前處理方法，樣品經(jīng)1%乙酸乙腈提取，PSA和GCB混合吸附劑凈化，結(jié)合UPLC-MS/MS對(duì)香蕉全蕉和蕉肉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯同時(shí)進(jìn)行定性定量分析。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，在0.001～0.1 ?g/mL范圍內(nèi)，吡蟲啉和高效氯氰菊酯線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r > 0.9991。方法平均回收率為84.91%～104.78%，RSD為1.23%～9.69%;檢出限為1 pg，定量限為0.01 mg/kg。該法前處理操作簡(jiǎn)單、溶劑用量少，方法的精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度均符合殘留試驗(yàn)要求，為香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯殘留分析研究提供參考。

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