母雞卵巢中不同等級(jí)卵泡的閉鎖研究

扈琴吉

摘 要：在產(chǎn)蛋高峰期，母雞的卵巢中含有30～100個(gè)卵黃色卵泡，直徑在1～8mm之間。一般母雞體內(nèi)卵泡數(shù)量與卵泡直徑成反比，例如雞體內(nèi)有約20個(gè)直徑為1～2mm和1個(gè)直徑為7～8mm的卵泡，直徑>8mm的卵泡數(shù)約為4～7個(gè)。本研究通過蘇丹黑B染色法發(fā)現(xiàn)：雞卵泡生長至3～5mm大約需要3d，再生長至5～8mm大約需要2d，生長至8mm到排卵需要6d。由于染料無法進(jìn)入較小的卵泡，因此本試驗(yàn)沒有檢測到1～3mm之間的數(shù)據(jù)。研究也發(fā)現(xiàn)雞體內(nèi)含有5～25個(gè)閉鎖卵黃色卵泡，這對(duì)于高產(chǎn)雞是正?，F(xiàn)象，但在整個(gè)試驗(yàn)中，只觀察到一個(gè)閉鎖的大卵黃色卵泡。因此本試驗(yàn)以這兩種閉鎖水平來定義不同卵泡的大小。本研究得出，雞的排卵率經(jīng)兩種互補(bǔ)機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，一種促進(jìn)卵泡在起始階段的生長，另一種使小卵黃卵泡閉鎖，抑制卵泡生長。

關(guān)鍵詞：母雞；等級(jí)卵泡；閉鎖

1 前言

產(chǎn)蛋母雞的卵巢含數(shù)百萬個(gè)卵泡（Hutt，1949），其中眼觀可見的卵泡數(shù)高達(dá)數(shù)千個(gè)（Pearl & Schoppe，1921）。目前研究主要集中于直徑>1mm的卵泡，是因?yàn)檫@些卵泡正處于發(fā)育階段（Marza & Marza，1935），而6mm左右的卵泡容易閉鎖（Fell，1923），>8mm的卵泡通常可以發(fā)育至約40mm并排卵。>8mm卵泡的閉鎖對(duì)于生殖高峰期的禽類來說是罕見的，除非外界環(huán)境的應(yīng)激導(dǎo)致母雞停止產(chǎn)卵（Erpino，1969，1973；Kern，1972）。卵泡的閉鎖通常發(fā)生于季節(jié)性繁殖的禽類，在高產(chǎn)季節(jié)到達(dá)最高峰。

然而，只有在卵泡生長階段才能評(píng)估卵泡閉鎖對(duì)活躍卵巢功能的作用。目前，大卵黃卵泡的生長已經(jīng)被廣泛研究，它們被認(rèn)為是處于“快速增長階段”且具有等級(jí)結(jié)構(gòu)的卵泡（Marza & Marza， 1935；Warren & Conrad，1939；Lacassagne，1957，1960；Smith，1959；Bacon & Skala，1968；Gilbert & Wood-Gush，1971；Gilbert，1972；Oribe，1973）。相比之下，母雞體內(nèi)100個(gè)左右的小卵黃色卵泡幾乎未被研究，是因?yàn)樗鼈兊纳L速度差別較大（Romanoff & Romanoff，1949；Griffin，Perry & Gilbert，1983）。Marza & Marza（1935）認(rèn)為卵泡生長到3～6mm大約需要60d，但有研究已經(jīng)表明卵泡經(jīng)24h就能生長到4～7mm（Warren & Conrad，1939；Oribe，1973）。Opel（1958）和Nalbandov（1959，1961）對(duì)于卵巢內(nèi)促卵泡激素（FSH）的水平觀察顯示，卵泡增長所需的時(shí)間介于這兩個(gè)數(shù)值之間。注射FSH后幾天內(nèi)就可以增加小卵泡和大卵黃卵泡的數(shù)量。同樣，我們對(duì)小卵黃卵泡的觀察結(jié)果表明，達(dá)到相應(yīng)的數(shù)量需要超過24h（Griffin et al.，1983）。

研究小卵黃卵泡的群體特征對(duì)于理解大卵黃卵泡等級(jí)結(jié)構(gòu)的形成以及家禽蛋產(chǎn)量是至關(guān)重要的。因此，我們使用脂溶性染料蘇丹黑B標(biāo)記卵泡的方法，對(duì)產(chǎn)蛋高峰期高產(chǎn)母雞品系進(jìn)行檢測（Warren & Conrad，1939；Bacon & Cherms，1967，1968；Bacon & Skala，1968；Gilbert，1972；Oribe，1973）。

2 材料與方法

將100只母雞用個(gè)體雞籠進(jìn)行飼養(yǎng)，使其自由采食和飲水。每天照明時(shí)間設(shè)置為14h（04：30～18：30）。兩個(gè)試驗(yàn)采用相同方法處理。

2.1 隨機(jī)選擇60只母雞，每只母雞在09：00～10：00之間飼喂一個(gè)明膠膠囊（大小3號(hào)，含有100mg蘇丹黑B），飼喂膠囊后放回籠位。在預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)飼喂后1、3、7和10d的雞進(jìn)行靜脈注射過量戊巴比妥鈉致死。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)選取的時(shí)間節(jié)點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，后續(xù)試驗(yàn)中每隔1、2、3、4、5和6d致死雞（6只/組），從卵巢取出直徑>8mm的卵泡并計(jì)數(shù)。其余部分將卵巢在鹽水中短暫沖洗，并且將所有直徑>1mm的卵泡取出并置于10%福爾馬林溶液中。這種固定方式不會(huì)顯著影響卵泡的大?。℅ilbert，Hardie&Perry，1982）。蛋黃變硬后（2～3d固定），檢測禽類產(chǎn)生的卵染料是否存在。本試驗(yàn)未測量閉鎖卵泡，因?yàn)闊o法確定卵泡收縮的程度。此外，本試驗(yàn)也檢查了經(jīng)染料處理后的母雞所產(chǎn)蛋的染色情況。

2.2 隨機(jī)選擇24只雞，飼喂含有100mg蘇丹黑B的明膠膠囊。收集所產(chǎn)的雞蛋，放置30d后煮沸，蛋黃一分為二，記錄染料情況。由于存在個(gè)別雞只未能攝取到染料，因此處理的數(shù)據(jù)與表格中的數(shù)據(jù)存在差異。

3 結(jié)果

3.1 卵泡數(shù)量 試驗(yàn)1中分別檢查了3種類型的卵泡：直徑1～8mm、大于8mm和閉鎖卵泡。閉鎖卵泡表面具有小的出血點(diǎn)，有的甚至出現(xiàn)變形或皺縮的外觀。在檢測的閉鎖卵泡中我們觀察到卵泡最小直徑為1mm，最大直徑為1～8mm。所有>8mm的卵泡都是可排卵的。

從本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在含有活性卵泡（1～8 mm）的35只雞中，有7只雞的卵泡數(shù)達(dá)到30～40個(gè)，6只雞有41～50個(gè)，8只雞有51～60個(gè)，8只雞有61～70個(gè)，2只雞有71～80個(gè)，2只雞有81～90個(gè)，2只雞有91～100個(gè)；平均每只雞約有56個(gè)卵泡。此外，該雞群中閉鎖卵泡數(shù)量為3～26個(gè)不等（1只3個(gè)，8只6～10個(gè)，12只11～15個(gè)，7只16～20個(gè)，5只21～25個(gè)，2只26個(gè)），約占活卵泡數(shù)量的27%左右。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管不同雞體內(nèi)的活卵泡數(shù)（1～8mm）存在一定的差異，但卵泡在各個(gè)層析結(jié)構(gòu)中的數(shù)量相對(duì)恒定，即每個(gè)數(shù)量等級(jí)結(jié)構(gòu)的雞約集中在5只或6只，很少有4只或7只的存在。同樣，閉鎖卵泡的數(shù)量與其他卵泡類別的數(shù)量之間沒有相關(guān)性。

從表1中發(fā)現(xiàn)，有活性的卵泡（1～8mm）隨著卵泡直徑的增加，卵泡數(shù)量穩(wěn)定下降。盡管個(gè)體雞體內(nèi)較大的卵泡數(shù)量較少，但是這種現(xiàn)象在個(gè)體間并不明顯，因?yàn)橛谐^一半的雞體內(nèi)沒有7～8mm卵泡，少數(shù)雞有2～4個(gè)大卵泡，總體趨勢顯著。

3.2 卵泡生長速度 本試驗(yàn)首先在第0天給雞飼喂單一劑量的蘇丹黑B，隨后通過確定染色的卵泡在卵巢中生長發(fā)育所需要的時(shí)間來判斷卵黃卵泡的生長速度。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)染料進(jìn)入卵泡的時(shí)間不超過24h。在第1天，染料大多存在于>3mm的卵泡中，且集中于卵黃的外部區(qū)域，并延伸約0.5～1mm的深度。在第2天，3～4mm的卵泡中未見染料，或者染色在>5mm卵泡的外層。此時(shí)，染色模式根據(jù)卵泡大小表現(xiàn)出差異。在>6mm的卵泡中，染料呈斷層存在，在5～6mm的卵泡中染料向卵黃核擴(kuò)散，4～5mm的卵泡中，整個(gè)卵黃被輕微染色。在本試驗(yàn)所檢查的卵黃中發(fā)現(xiàn)，較小的卵泡含有輕微染色的卵黃核心，較大的卵泡具有強(qiáng)烈的染色層，在橫截面中可見染色環(huán)。這種差異染色模式反映了4～5mm卵泡在生長階段中卵黃成分的變化（Marza & Marza，1935），這種改變促進(jìn)卵黃層的穩(wěn)定構(gòu)象（Warren & Conrad，1939）。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記的卵泡比例隨時(shí)間下降；給雞飼喂蘇丹黑B后，第6天未在3～8mm的卵泡中發(fā)現(xiàn)染料，第10天，在8～40mm的卵泡中發(fā)現(xiàn)少數(shù)染料；本研究前期發(fā)現(xiàn)卵泡生長到3～8mm大約需要5d時(shí)間。因此表2和表3的結(jié)果與試驗(yàn)1結(jié)果相一致。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)在特定時(shí)間間隔內(nèi)進(jìn)行，表2顯示卵泡一般生長模式，表3顯示特殊生長模式。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，每一只雞不論在哪個(gè)時(shí)間段，染色和未染色的卵泡之間都有明顯分界。該結(jié)果表明雞卵泡的生長是同步的。如表3所示，通過測量每個(gè)卵巢中最小的染色卵泡或最大的未染色卵泡，可以確定它們從一個(gè)大小級(jí)別到另一個(gè)大小級(jí)別的生長速度。然而，許多卵泡會(huì)演變成閉鎖卵泡，并且在演變的早期階段此類卵泡是無法被檢測到，因此該方法會(huì)有一定的偏差。如果所有已染卵泡隨后開始退化，那么這種檢測方法會(huì)高估卵泡的生長速度，如果演變成閉鎖卵泡，則會(huì)低估其生長速度。同樣，如果最大的未標(biāo)記卵泡演變成閉鎖卵泡（如表3中第1天5～6mm中未標(biāo)記的卵泡）則會(huì)高估其生長速度，如果所有未標(biāo)記的卵泡開始退化，則會(huì)低估其生長速度。在卵泡生長發(fā)育后期會(huì)增加這4個(gè)錯(cuò)誤數(shù)據(jù)的幾率。

卵巢中閉鎖卵泡的再吸收率通過染色時(shí)間長度表示。在第1天，染色卵泡數(shù)量約占閉鎖卵泡的一半，有些在第3天仍然明顯，到第6天染色的閉鎖卵泡消失。

盡管染色標(biāo)記的方法僅適用于卵黃的再吸收而不適用于整個(gè)卵泡，但試驗(yàn)結(jié)果表明，卵巢在幾天內(nèi)會(huì)自動(dòng)消除閉鎖卵泡。研究顯示，在5d內(nèi)，卵泡演變?yōu)殚]鎖卵泡過程中活卵泡的丟失量約為40%。

3.3 檢測染色雞蛋 在試驗(yàn)2中，從第0天給予母雞飼喂單劑量的蘇丹黑B染料，通過染色蛋黃的時(shí)間估計(jì)生長速度。不同母雞產(chǎn)出已染蛋黃是雞蛋需要9～13d的時(shí)間（表4）。隨后本試驗(yàn)采用Oribe，Kameyama&Kayano（1975）的研究方法。顯示雞蛋染料圖案的漸進(jìn)變化，并標(biāo)明最后一個(gè)染色的蛋黃與第一個(gè)未染色蛋黃的時(shí)間間隔。研究發(fā)現(xiàn)，染色第2天，在一個(gè)狹窄的淺色蛋黃區(qū)橫截面發(fā)現(xiàn)環(huán)狀染色帶。連續(xù)觀察8d（表4），發(fā)現(xiàn)染色帶從較小染色環(huán)演變?yōu)椴灰?guī)則形狀。該結(jié)果與之前用于確定快速生長期染料環(huán)的結(jié)果一致（Warren & Conrad，1939；Lacassagne，1960；Bacon & Skala，1968；Gilbert，1972；Oribe，1973），其中最小的規(guī)則染色環(huán)內(nèi)徑約為5mm。隨后將雞蛋放置3d（表4），發(fā)現(xiàn)在蛋黃核心4～5mm的直徑范圍內(nèi)的染色呈彌散型。該3d的統(tǒng)計(jì)結(jié)果與卵泡從3mm增加至5mm的生長時(shí)間相一致（表2和表3）。

染色蛋的有序生產(chǎn)是該試驗(yàn)的一個(gè)前提（至少針對(duì)3mm以上的卵泡）。因此可以保證在一系列染色蛋中間未發(fā)現(xiàn)未染色蛋，反之亦然。同樣，蛋黃中染色形狀的變化趨勢也沒有中斷。此外，也未在蛋黃與蛋黃染色環(huán)中間發(fā)現(xiàn)染色現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本項(xiàng)研究從多角度闡明了國內(nèi)母雞卵巢功能，然而這些研究迄今為止很少被關(guān)注。本試驗(yàn)雖然只使用了一個(gè)母雞品種，但為與其他產(chǎn)母雞品種進(jìn)行比較奠定了基礎(chǔ)。例如，一項(xiàng)關(guān)于肉雞或火雞的類似研究可以闡明這些雞蛋產(chǎn)量相對(duì)較差的情況，此外選擇一個(gè)品種進(jìn)行研究來確定母雞是否隨著日齡的增加，通過改變體內(nèi)多項(xiàng)相關(guān)代謝機(jī)制而引起產(chǎn)蛋量的下降。

在產(chǎn)蛋高峰期，母雞的卵巢約含有60個(gè)1～8 mm的卵泡。然而，本研究發(fā)現(xiàn)卵泡數(shù)量隨著卵泡大小的增加而相應(yīng)減少。從3mm到排卵階段，卵泡的生長呈連續(xù)狀態(tài)，盡管不同雞之間存在一定差異，但從以下數(shù)據(jù)中可以得到近似生長狀態(tài)：從3mm到5mm，需3d（表4）；從5mm到8mm，需2d（表3和表4）；從8mm到排卵，需6d（表3和表4）。由于小于3mm的卵泡不能吸收蘇丹黑B染料，因此無法檢測1～3mm的卵泡生長速度。

如先前研究發(fā)現(xiàn)（Gilbert，1971），小的卵黃色卵泡不構(gòu)成傳統(tǒng)的“池”，也不處于“靜止”狀態(tài)。如果處于靜止?fàn)顟B(tài)，通常發(fā)生在直徑小于1mm的卵泡中。直徑>3mm或者>1mm卵泡的生長方式與其他等級(jí)結(jié)構(gòu)卵泡的生長方式相同。此外，本試驗(yàn)利用更加直觀的方式檢測到卵泡從3mm生長至8mm大約需要5d的時(shí)間，比Marza和Marza（1935）建議的染料時(shí)間短，但是超過了24h（Warren & Conrad，1939；Oribe，1973）。

隨著卵泡體積的增加，卵巢中卵泡的數(shù)量普遍減少，并且大約50%的母雞沒有7～8mm大小的卵泡。這在母雞體內(nèi)的較大卵泡中是常見的差異，并且這種差異也調(diào)節(jié)了雞的產(chǎn)蛋率（Warren & Conrad，1939；Lacassagne，1960；Gilbert & Wood-Gush，1971；Gilbert，1972）。然而，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)約有80%甚至更高比例的此類母雞，可能是因?yàn)槁雅菰?～8mm級(jí)別時(shí)的存在時(shí)間不超過1d。

評(píng)價(jià)卵巢功能的一個(gè)重要的指標(biāo)是對(duì)閉鎖小卵黃色卵泡進(jìn)行量化。在以前的報(bào)道中，雖然已經(jīng)認(rèn)識(shí)到卵泡閉鎖是禽類卵巢的一個(gè)共性，但卻并未給出相關(guān)信息（Dubuisson，1906；Fell，1925； Davis，1942；Moreau，Wilk & Rowan，1947；Romanoff & Romanoff， 1949；Marshall， 1957； Lofts & Murtón，1973；Gilbert，1979）。在卵巢中通?？梢钥吹郊s10～15個(gè)閉鎖卵泡，最多可達(dá)30個(gè)。這些統(tǒng)計(jì)數(shù)字排除了閉鎖初始或末期階段的卵泡，以及通過肉眼無法識(shí)別的卵泡。季節(jié)性繁殖禽類卵泡的閉鎖主要發(fā)生在卵巢退化期間（Erpino，1969，1973；Kern，1972）。本研究中的母雞處于產(chǎn)蛋高峰期，但閉鎖卵泡的發(fā)生率仍然很高。

卵巢中卵泡的初始直徑大約為1mm或更小。在卵巢內(nèi)，一直存在有大約20個(gè)1～2mm的卵泡，但不確定這是否恰好代表了卵巢中1d的卵泡初始量。然而，可以以此評(píng)估卵巢發(fā)育卵泡的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋母雞一生可產(chǎn)多達(dá)1500個(gè)雞蛋（Romanoff & Romanoff，1949），如果每個(gè)卵巢產(chǎn)20個(gè)卵泡，那么將需要大約30000個(gè)卵泡。然而，這僅占卵巢內(nèi)卵泡總數(shù)的2%左右（Hutt，1949）。因此，與其他脊椎動(dòng)物一樣，母雞需要產(chǎn)出更多的卵泡，并通過閉鎖消除多余的卵泡（Greenwald， 1978；Jones，1978）。

閉鎖通常僅發(fā)生在較小的卵泡中，直到發(fā)育成卵圓形卵泡。因此，在任何時(shí)期可以排出卵泡數(shù)量的等級(jí)結(jié)構(gòu)，是由初始的卵泡數(shù)量（約1mm）和發(fā)育至8mm的卵泡閉鎖率決定的。因此存在兩種互補(bǔ)機(jī)制，并且每種機(jī)制在調(diào)節(jié)卵巢排卵能力中起著重要的作用。然而，對(duì)于調(diào)控卵泡初始數(shù)量或卵泡閉鎖率的研究甚少。雖然研究已經(jīng)證實(shí)FSH參與卵泡的生長，但其具體機(jī)制及在卵巢內(nèi)的作用位點(diǎn)尚不清楚（Gilbert，1971；Lofts & Murtón， 1973）。

之前認(rèn)為較大的卵黃色卵泡（直徑>8mm）與小的卵黃色卵泡不同，是因?yàn)?mm的卵黃色卵泡生長速度快而且卵泡內(nèi)含有黃色蛋黃。然而，研究發(fā)現(xiàn)小的卵黃色卵泡也以每天增加約1mm直徑的速度生長，并且這些卵泡中同樣含有部分黃色蛋黃（Griffin et al.，1983）。此外，根據(jù)卵泡大小的等級(jí)結(jié)構(gòu)分布，每個(gè)等級(jí)結(jié)構(gòu)中的卵泡數(shù)都比直徑>8mm的卵泡數(shù)多。因此，有序排卵期是指卵泡從3mm甚至更小直徑開始生長發(fā)育的時(shí)期。

然而，直徑>8mm的卵泡與小于8mm的卵泡之間確實(shí)存在著重要的差別。大卵黃卵泡通常會(huì)排卵；在產(chǎn)蛋期間，母雞的大卵黃色卵泡不會(huì)變得無關(guān)緊要。相比之下，小卵黃卵泡通常會(huì)發(fā)育成閉鎖卵泡。產(chǎn)生這種規(guī)律的相關(guān)生理機(jī)制尚不明確。然而研究發(fā)現(xiàn)，在直徑約8mm的卵泡中，顆粒細(xì)胞的存在可能會(huì)改變卵泡的功能，因?yàn)轭w粒細(xì)胞會(huì)停止分泌轉(zhuǎn)運(yùn)體，直接轉(zhuǎn)移到卵黃形成卵母細(xì)胞的特化體（Griffin et al.，1983），隨后發(fā)生類固醇脫氫酶的第一步反應(yīng)（Davidson，Gilbert & Wells，1979）。這一結(jié)果是否與卵泡抵抗閉鎖的能力直接相關(guān)，或者是否只是一個(gè)狀態(tài)變化還需進(jìn)一步調(diào)查。

（注：本文譯自A.B.Gilbert的《Role of atresia in establishing the follicular hierarchy in the ovary of the domestic hen （Gallus domesticus） 》；本文翻譯省略了參考文獻(xiàn)， 如有需要請(qǐng)查閱原文。）