朗德鵝體組織中MTP基因的發(fā)育表達(dá)及其在填飼后的變化研究

葉健強(qiáng) 康潤敏

摘要[目的]研究MTP基因在朗德鵝體組織中的表達(dá)量及填飼后的變化。[方法]采用RT-PCR方法，以朗德鵝為研究材料，研究了1、10、13、14和16周齡朗德鵝肝臟、小腸、腦、胸肌、腹肌、腹脂、皮脂和心肌組織以及填飼后肝臟與小腸組織中MTP基因的表達(dá)量。[結(jié)果]1周齡，MTP基因僅在朗德鵝小腸組織中表達(dá);10周齡，除在肝臟和小腸組織中外，首次發(fā)現(xiàn)MTP基因在朗德鵝腦組織中也有表達(dá);MTP基因在肝臟和小腸中的表達(dá)量隨周齡的增加呈逐步上升的趨勢（P<0.05）; 1～13周齡，MTP基因在朗德鵝小腸中的表達(dá)量高于肝臟;14～16周齡，MTP基因在朗德鵝小腸中的表達(dá)量低于肝臟;填飼后MTP基因在朗德鵝肝組織中的表達(dá)量降低，而MTP基因在小腸組織中的表達(dá)量升高。[結(jié)論]MTP基因在朗德鵝脂肪沉積和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中具有極重要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞朗德鵝;MTP基因;發(fā)育階段;表達(dá)

中圖分類號S835;Q756文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2019）02-0075-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.022

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

填飼誘導(dǎo)的鵝肥肝是由于食物中碳水化合物引起的在肝臟中強(qiáng)烈的脂肪生成[1-2]，特別是大量的中性脂肪甘油三酯（triglyceride，TG）在肝實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的異常沉積。微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（microsomal triglyceride transfer protein，MTP）是由大亞基（97 ku）和二硫化合物異構(gòu)酶（55 ku）（protein disulfide-isomerase，PDI）2種多肽構(gòu)成的異質(zhì)二聚復(fù)合體，其生理作用是加速細(xì)胞膜或亞細(xì)胞膜之間甘油三酯、膽固醇脂（cholesteryl ester，CE）和卵磷脂（phosphatidylcholine，PC）等的轉(zhuǎn)運(yùn)和合成[3]。研究發(fā)現(xiàn)，動物體內(nèi)肝臟和小腸細(xì)胞中形成富含TG的極低密度脂蛋白（very low density lipoproteins，VLDL）和乳糜微粒（chylomicrons，CM）的組裝形成和向血漿分泌過程中主要依賴于MTP（在禽類上，由于小腸淋巴系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，因此小腸中形成的主要是門靜脈微粒）[4]。MTP在載脂蛋白B（Apolipoprotein B，apoB）翻譯和轉(zhuǎn)移到（endoplasmic reticulum，ER）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜時，可將體內(nèi)內(nèi)源性合成的TG和以CM形式的食物性TG轉(zhuǎn)運(yùn)到apoB上，并使其構(gòu)象折疊恰當(dāng)，進(jìn)而可組裝形成一個含有中性脂質(zhì)中心的脂蛋白顆粒，以便將TG向外周組織分泌。在體內(nèi)，由于MTP是參與VLDL和CM或門靜脈微粒組裝和分泌過程中的必需因子，因此MTP是調(diào)節(jié)肝臟和外周組織脂質(zhì)平衡的一個關(guān)鍵因子[5]。

近年來，Lu等[6]和Farese等[7]在小鼠的胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)其卵黃囊組織中有MTP基因的表達(dá);同時，Nielsen等[8]和Fournier等[9]發(fā)現(xiàn)MTP基因在心臟組織中同樣也有較高地表達(dá)，但目前人們在水禽（鵝）脂肪代謝調(diào)控機(jī)理和基因組織表達(dá)上的研究尚未見報道。筆者首次以產(chǎn)肝性能較好的朗德鵝作為試驗材料，對MTP基因在朗德鵝不同組織中的發(fā)育表達(dá)及其在填飼后的變化進(jìn)行研究，旨在為研究水禽肝臟脂蛋白合成、組裝與分泌的表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗動物及其飼養(yǎng)管理

選用健康朗德鵝雛鵝（公鵝）60只，隨機(jī)分為對照組（45只）和填飼組（15只）進(jìn)行飼養(yǎng)（四川省原種水禽場提供）。參照Fournier等[9]的飼養(yǎng)方式，整個飼養(yǎng)期采用自由飲水。0～4周，自由采食雛鵝料（代謝能12 351 kJ/kg，粗蛋白20.5%）;5～13周，自由采食生長鵝飼料（代謝能10 886 kJ/kg，粗蛋白13.8%）并按照精飼料量的5%添加青飼料。4～5、6～8、9～13周齡飼料添加量分別為150、165和120 g/（只·d）。13周齡填飼組開始預(yù)填飼，預(yù)填飼時只添加精料且供給量逐漸過渡為自由采食;對照組，繼續(xù)飼喂生長鵝飼料，自由采食。14周齡開始填飼，每天機(jī)器填飼5次，填飼期2周，其飼料配方如下：煮熟的黃玉米、3%鵝油和1.5%食鹽等（代謝能14 109 kJ/kg，粗蛋白9.0%）。

1.2樣品采集

分別于1、10、13、14和16周齡采集對照組和填飼組中鵝的肝臟、小腸組織樣各5 g，其中10周齡另采集胸肌、腿肌、皮脂、腹脂、腦和心臟等組織樣各5 g。將采集的各組織樣品，先使用DEPC處理水洗去表面血液，然后用剪刀迅速剪成50～100 mg的組織塊，放入2 mL凍存管內(nèi)并做好標(biāo)記后迅速存于液氮中速凍，以備總RNA提取，速凍后的樣品于-70 ℃液氮罐中保存，以供各組織總RNA的抽提。

1.3試驗方法

1.3.1各組織總RNA的提取。

取-70 ℃條件下保存的各種組織50 mg，按照Beyozol kit使用說明書分別提取各組織的總RNA，使用紫外分光光度計測定總RNA的濃度和純度（OD260/ OD280為1.8～2.0），利用1.0%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，置于-70 ℃條件下貯存或立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.3半定量分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

抽提的總RNA及RT-PCR產(chǎn)物使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行;電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)（BTS-20.M，UVItec，Inc.）進(jìn)行拍照;半定量分析軟件用Quantity one進(jìn)行，并計算目的基因的相對表達(dá)量。試驗數(shù)據(jù)用SAS 6.12統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計與分析，并采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA的提取和純化

利用RNA抽屜試劑盒分別對不同發(fā)育階段和不同處理間的多種組織總RNA進(jìn)行提取，取5 mL總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。由圖1A可以看出，抽提總RNA的28S、18S條帶清晰、銳利，且28S條帶亮度約為18S條帶的2倍左右，說明所抽提的總RNA完整;但因未經(jīng)DNase Ⅰ? 處理，其總RNA中含有大量DNA雜帶，經(jīng)DNase I處理后（圖1B），說明已經(jīng)將DNA的污染去除且RNA的完整性沒有被破壞，因此其處理是有效的。通過吸光度定量分析，各組織總RNA OD260/OD280為1.8～2.0，表明抽提RNA具有較高的質(zhì)量，可進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2MTP基因在朗德鵝各組織中的表達(dá)

從圖2和圖3可以看出，1周齡MTP基因僅在朗德鵝小腸組織中表達(dá)，10周齡MTP基因在朗德鵝肝臟、小腸和腦組織中均有表達(dá)，在胸肌、腿肌、皮脂、腹脂和心臟組織中則未檢測到表達(dá)。

2.3MTP基因在不同發(fā)育階段朗德鵝肝臟和小腸組織中的表達(dá)量

MTP基因在朗德鵝肝臟和小腸組織中的表達(dá)量隨日齡的增加呈上升趨勢（圖4），且差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

2.4填飼后MTP基因mRNA在朗德鵝肝臟和小腸組織中的表達(dá)量

填飼后，朗德鵝肝臟組織中MTP基因mRNA表達(dá)豐度降低，但差異不顯著（P>0.05）;小腸組織中MTP基因mRNA表達(dá)豐度卻顯著升高（P<0.05）（圖5）。

3討論

3.1MTP基因在朗德鵝不同組織中的表達(dá)特性

該研究首次測定了朗德鵝不同組織中MTP基因mRNA表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10周齡MTP基因僅在肝臟、小腸和腦組織中有表達(dá)，而在其他脂肪和肌肉組織中（如腹脂、皮脂、胸肌、腿肌和心臟組織）中均不表達(dá);16周齡，肝臟和小腸組織中仍檢測到MTP基因的表達(dá)。此表達(dá)特點與Davis[10]、Lu等[11]、Farese等[7]和Terasawa等[12]在哺乳動物（豬和小鼠）肝臟和小腸組織中均發(fā)現(xiàn)有MTP基因表達(dá)的結(jié)論一致;這都證實了MTP基因在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中的生理作用——MTP基因在ER內(nèi)膜中將TG、CE和PC等的轉(zhuǎn)運(yùn)到apoB上并協(xié)同組裝成富含apoB的脂蛋白（VLDL）向血漿中分泌[13-14]。由于在哺乳動物上發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的脂蛋白主要是肝臟組織中合成的VLDL、小腸組織中的乳糜微粒和胎兒的卵黃囊組織中的VTG[15];在禽類上，Bensadoun等[16]認(rèn)為除肝中能合成VLDL和VTG外，由于其小腸淋巴系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，禽類小腸中合成的脂蛋白被直接轉(zhuǎn)運(yùn)至門靜脈系統(tǒng)進(jìn)行代謝，這種脂蛋白稱為門靜脈微粒（potimicron）。因此，MTP基因在朗德鵝肝臟和小腸組織中發(fā)現(xiàn)有表達(dá)，反映了禽類上述的生理特點——禽類體內(nèi)VLDL和門靜脈微粒的合成和分泌主要依賴于MTP基因的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能[17]。

筆者首次發(fā)現(xiàn)MTP基因在朗德鵝腦組織中有表達(dá)，這與Terasawa等[12]、Nielsen等[18]、Nielsen等[19]、Borén等[20]、Walzem等[21]和Iqbal等[22]在小鼠卵黃囊組織、人類心肌組織和雞腎臟組織中發(fā)現(xiàn)有MTP基因表達(dá)的特點并不一致;一些研究表明，MTP基因在某組織中表達(dá)可能與該組織中脂蛋白的形成和分泌有關(guān)，且是該組織中沉積的過多TG向外轉(zhuǎn)運(yùn)的一種新途徑，同時也依賴于MTP基因啟動子SREBP1的表達(dá)[12，18-20]。因此，根據(jù)MTP基因的生理作用推測，MTP基因在朗德鵝腦組織中表達(dá)與其腦組織中某種脂蛋白的合成和分泌有關(guān)，但MTP基因是否參與腦組織中某種脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控有待進(jìn)一步研究。

47卷2期葉健強(qiáng)等朗德鵝體組織中MTP基因的發(fā)育表達(dá)及其在填飼后的變化研究

3.2MTP基因在不同發(fā)育階段朗德鵝肝臟和小腸組織中的表達(dá)特性

目前，對哺乳動物MTP基因不同發(fā)育階段的表達(dá)特性研究較少。Shelton等[23]、Plonné等[24]和Lu等[6]分別對胚胎期小鼠中MTP基因大亞基、哺乳期大鼠初級肝細(xì)胞和不同發(fā)育階段豬肝臟和小腸組織中MTP基因的表達(dá)進(jìn)行了初步研究;Levy等[25]研究了人胚胎期小腸組織中MTP基因的表達(dá)特性。在禽類脂肪代謝上，不僅缺乏對MTP基因在體內(nèi)、外的表達(dá)特性研究，不同發(fā)育階段MTP基因在組織上的表達(dá)特性研究未見報道。該研究采用RT-PCR法首次以朗德鵝1、10、13、14和16周齡5個不同發(fā)育階段研究了肝臟和小腸組織中MTP基因的表達(dá)特性，結(jié)果表明1周齡MTP基因僅在小腸組織中表達(dá);10周齡，檢測到MTP基因在肝和小腸組織中均有表達(dá);同時發(fā)現(xiàn)MTP基因不僅在不同的發(fā)育階段表達(dá)豐度存在差異，而且不同組織間其表達(dá)豐度也存在差異，即10～16周齡MTP基因在肝臟與小腸組織中的表達(dá)量均呈顯著上升趨勢; 1～13周齡小腸組織中MTP基因表達(dá)豐度高于肝臟，14～16周齡MTP基因在小腸組織中表達(dá)豐度卻低于肝臟。

Lu等[6]研究發(fā)現(xiàn)新生乳豬胎兒期MTP基因在肝臟和小腸組織中都有較高表達(dá)，但出生后MTP基因在空腸組織中維持較高的表達(dá)直到泌乳結(jié)束，而在回腸組織中其表達(dá)量在出生后2 d降低;出生后，MTP基因在肝組織中的表達(dá)一直維持較低的表達(dá)水平。Black[26]和Lu等[6]認(rèn)為此階段MTP基因的表達(dá)主要與胎兒期或剛出生時體內(nèi)脂質(zhì)的吸收和代謝特點有關(guān)，因為此階段主要依靠胎盤或母乳有效地吸收營養(yǎng)和利用食物中的脂類物質(zhì)（以TG為主），并且體內(nèi)50%左右的能量供應(yīng)來源與母乳中的脂質(zhì)代謝;MTP基因發(fā)揮脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)作用形成乳糜微粒，進(jìn)而向外周組織分泌。Raabe等[27]認(rèn)為新生動物小腸組織中較高的MTP基因表達(dá)是必要的，也反映出其在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的重要性，且在缺乏MTP基因表達(dá)的小鼠胚胎早期不能成活的研究中得以證實。此外，1周齡雛鵝所利用的營養(yǎng)物質(zhì)不同于胚胎期和出殼后2～3 d，后者其主要通過卵黃囊將母體的營養(yǎng)成分供給雛鵝;而此階段的雛鵝主要以攝入外源性營養(yǎng)物質(zhì)在小腸絨毛組織中被分解、組裝成門靜脈微粒直接進(jìn)入肝臟中[7]來維持體內(nèi)的能量和蛋白需求;另外，機(jī)體發(fā)育早期主要是體細(xì)胞增長，脂肪沉積較少，則肝組織中合成的脂質(zhì)相對較少，進(jìn)而肝組織中脂質(zhì)通過MTP基因組裝、形成并轉(zhuǎn)運(yùn)到血漿中的富含TG的VLDL就更為有限。因此，為了維持和生長發(fā)育的需求，此階段雛鵝小腸組織相對肝臟組織的生理作用較大，所以MTP基因在這2個組織間的表達(dá)呈差異性。14～16周齡，機(jī)體已發(fā)育成熟，此時主要是以脂肪沉積為主[15]，因此在肝臟中合成的TG量也增大，進(jìn)而通過MTP基因脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)作用將TG和apoB轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合在一起形成能夠分泌到血漿中VLDL的量也有所增加[28]，此階段肝組織中MTP基因表達(dá)量的提高與滿足自身營養(yǎng)需要是一致的;同時，此階段其采食量加大，則在小腸組織中被分解的脂類物質(zhì)的量提高，從而加大了MTP基因的轉(zhuǎn)運(yùn)作用。

3.3填飼前后朗德鵝MTP基因在肝臟和小腸組織中表達(dá)特性

14～16周齡，在肝臟和小腸中的表達(dá)都進(jìn)一步提高且肝組織中的表達(dá)量高于小腸，這與飼料成分（高能的碳水化物—玉米）、飼養(yǎng)方式（填飼）和此期間體內(nèi)脂肪沉積強(qiáng)度有密切關(guān)系。此階段，食物中大量碳水化物由小腸消化組織吸收后，使通過血漿運(yùn)輸?shù)介T靜脈的葡萄糖濃度大大提高，進(jìn)而促進(jìn)肝內(nèi)的脂質(zhì)（TG）合成[29]。肝細(xì)胞ER中MTP基因的主要作用是將肝內(nèi)合成的大量TG轉(zhuǎn)運(yùn)到apoB上，并與其一起形成富含TG的VLDL向血漿中分泌，其目的在于調(diào)節(jié)TG在肝內(nèi)和肝外脂肪組織之間的平衡，則MTP基因的表達(dá)量大幅度提高。同樣，在小腸組織中，隨著采食量的增加，進(jìn)入到小腸組織中的食物源性脂質(zhì)含量也加大，小腸中向門靜脈系統(tǒng)分泌的門靜脈微粒的量增加，而MTP基因在門靜脈微粒的形成和分泌中是必需的[15]，因此MTP基因在小腸組織中的表達(dá)也大幅度提高。然而，小腸組織中MTP基因的表達(dá)量低于肝組織，這種差異與家禽的生理特點相一致，因為家禽的脂肪組織發(fā)育、脂肪沉積和蛋黃的形成主要取決于血漿中的TG濃度，但其肝外組織合成的脂肪很有限，血漿中的TG主要來源于日糧或肝臟，而日糧中的脂肪含量很有限，因此肝臟在禽類脂類代謝過程中起著至關(guān)重要的作用[15]。此外，由于禽類的小腸淋巴系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，小腸絨毛細(xì)胞內(nèi)合成的脂蛋白微粒直接通過門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，并在其中代謝;Wetterau等[13]研究發(fā)現(xiàn)，MTP基因在肝臟和小腸組織中的表達(dá)主要受脂質(zhì)和胰島素調(diào)節(jié)，但在2個組織的反應(yīng)卻不相同，其認(rèn)為可能是因為MTP的蛋白質(zhì)水平與其表達(dá)水平間的變化敏銳程度不一致，這主要與體內(nèi)長期適應(yīng)有關(guān)。因此，填飼期間食物中大量的脂肪對肝組織中MTP基因表達(dá)的促進(jìn)作用較小腸大。此特性與在大鼠[30]和豬[31]的研究結(jié)果不同，在小鼠和豬中隨著日齡的增長，肝臟和小腸中MTP基因的表達(dá)量逐漸降低，直至成年后趨于穩(wěn)定，這可能是由于不同物種間消化生理和日糧組成在各發(fā)育生長階段不同所致。

總而言之，與豬[6]一樣，MTP基因在不同發(fā)育階段朗德鵝肝臟與小腸組織中的表達(dá)是以一種滿足自身營養(yǎng)需要的方式來進(jìn)行的。雖然，各物種自身的遺傳特性在MTP基因的表達(dá)上起主要作用，但飼料中脂肪的含量和類型同樣在調(diào)節(jié)其表達(dá)上起著重要作用。

4結(jié)論

MTP基因的表達(dá)具有組織差異性，其優(yōu)勢組織為肝臟和小腸，特有組織為腦;MTP基因在肝臟和小腸中的表達(dá)量隨周齡的增加呈逐步上升趨勢（P<0.05）; 1～13周齡，MTP基因在小腸中的表達(dá)量高于肝臟;14～16周齡，MTP基因在小腸中的表達(dá)量低于肝臟;填飼后MTP基因中肝組織中的表達(dá)水平有所降低，而MTP基因在小腸組織中的表達(dá)水平有所升高。MTP基因在鵝肥肝形成中具有重要的調(diào)控作用。

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