玫煙色棒束孢耐熱菌株的篩選及對麥長管蚜的致病力測定

趙建華 王宏民 張?zhí)旌? 張仙紅

摘要采用48℃恒溫水浴熱脅迫法對玫煙色棒束孢7個菌株進行了耐熱性測定。結果表明，熱脅迫45 min后，不同菌株的殘存活孢率差異顯著，其中IF502、IF904和IF9606菌株耐熱性較強，殘存活孢率均達50%以上;IF7606菌株耐熱性最差，殘存活孢率僅為28.70%;IF14、IF511和IF609菌株耐熱性居中，殘存活孢率34.72%～36.00%。對耐熱性強的IF502、IF904和IF9606三個菌株對麥長管蚜若蚜的致病力測定表明， IF904菌株在1×107孢子/mL時對麥長管蚜的致病力最高， 校正死亡率達88.20%，致死中時最短，為2.67 d。

關鍵詞玫煙色棒束孢;耐熱菌株;麥長管蚜;致病力測定

中圖分類號：S 435.122

文獻標識碼：B

DOI：10.16688/j.zwbh.2018047

蟲生真菌是一類重要的病原微生物，在害蟲的生物防治中發(fā)揮著重要作用。分生孢子作為蟲生真菌制劑的主要成分，在劑型加工、貯存運輸及田間應用中，會遇到高溫、紫外線等不利的環(huán)境條件。高溫不僅影響真菌孢子的萌發(fā)，還影響著孢子制劑的貯存穩(wěn)定性和田間宿存[13]，因此耐熱性（thermotolerance）是生防真菌的重要抗逆性指標。據報道，不同地區(qū)或同一地區(qū)的不同白僵菌菌株其耐熱性存在明顯差異[4];當環(huán)境溫度高于35℃時，一些球孢白僵菌的孢子萌發(fā)和生長都受到制約[5];持續(xù)或瞬間高溫都會使生防真菌制劑失活或者是喪失毒力[6]。夏季田間溫度經常達 35℃以上，田間植被一般會經歷數(shù)小時的持續(xù)高溫，這在一定程度上已經遠遠超過了很多蟲生真菌的溫度耐受力。

玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea Wize是一種重要的昆蟲病原真菌，對白粉虱、蚜蟲、小菜蛾幼蟲具有很強的致病性，是一種很有開發(fā)潛力的蟲生真菌，但不適宜的環(huán)境條件等因素嚴重影響了該菌的防治效果。研究表明，玫煙色棒束孢孢子萌發(fā)的適宜溫度為26～32℃，相對濕度85%以上，如果溫度超過35℃、濕度低于85%，大量的孢子不能萌發(fā)[78]，此外環(huán)境溫度還影響玫煙色棒束孢菌劑的貯藏時間和穩(wěn)定性[9]。據報道，菌株的耐熱性與其貯藏壽命存在顯著正相關關系。通過菌株耐熱力的測定，可以間接評估孢子的貯藏穩(wěn)定性[10]。因此獲得耐熱性較強的菌株是提高玫煙色棒束孢田間應用效果和延長貨架期的重要途徑。為此本研究擬通過熱脅迫篩選出玫煙色棒束孢耐熱性菌株，并測定耐熱菌株對麥長管蚜Sitobion avenae Fabricius若蚜的毒力，以獲得耐熱性較強且毒力較高的玫煙色棒束孢生防菌株。

1材料與方法

1.1供試材料

供試菌株：玫煙色棒束孢IF14、IF502、IF511、IF609、IF7606、IF904、IF9606菌株由山西農業(yè)大學昆蟲重點實驗室提供;

供試蚜蟲：供試麥長管蚜為室內采用‘晉麥47麥苗飼養(yǎng)的第3代7日齡若蟲。

1.2耐高溫菌株的篩選

1.2.1孢子懸浮液的制備

將4℃下斜面保存的玫煙色棒束孢各菌株在室溫下活化24 h后接種于PDA培養(yǎng)基上，并置于培養(yǎng)箱26℃培養(yǎng)7 d，用接菌刀將孢子輕輕刮下，用含0.1% Tween80的無菌水稀釋孢子懸浮液，加入葡萄糖使其終濃度為1%，制成4×106個/mL孢子懸浮液。

1.2.2分生孢子耐熱性測定

將各供試菌株孢子懸浮液置于48℃恒溫水浴鍋中45 min，取處理后的各菌株孢子懸浮液0.1 mL，采用凹玻片懸滴法于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36 h后在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)。每次觀察3～5個視野并求平均值，將未經處理的孢子設為對照（CK），每菌 3次重復。以48℃恒溫水浴45 min后的殘存活孢率作為衡量各菌株耐熱性的指標。

1.3玫煙色棒束孢不同耐熱菌株對麥長管蚜的毒力測定

將篩選獲得的玫煙色棒束孢耐熱菌株IF14、IF502、IF904、IF9606，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用接菌刀輕輕刮下孢子，并用含0.1% Tween80的無菌水配制成濃度為1×107個/mL的孢子懸浮液，以含0.1% Tween80無菌水作為對照（CK）。取各菌株孢子懸浮液1 mL用波特噴霧塔在100 kPa壓力下噴于供試麥長管蚜體表，沉降時間為1 s。待蟲體體表藥液晾干后置于小麥葉片上（濕棉球包裹小麥被剪斷的一端），并將帶蟲葉片置于培養(yǎng)皿內，封口膜封口后置于恒溫26℃、光照L∥D=12 h∥12 h的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，每天觀察并記錄蚜蟲的死亡情況，統(tǒng)計麥長管蚜的死亡率，連續(xù)觀察5 d。每處理設3次重復。

1.4玫煙色棒束孢IF904菌株對麥長管蚜的毒力測定

將篩選獲得的玫煙色棒束孢IF904菌株在 PDA 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)7 d后，用接菌刀輕輕刮下孢子，用含0.1% 的Tween80水溶液配制成濃度為 1×108個/mL 的孢子懸浮液，依次稀釋為1×107、1×106、1×105、1×104個/mL，用渦旋振蕩器將孢子懸浮液混合均勻用于毒力測定。每處理20頭試蟲，3次重復，以含0.1% Tween80 的無菌水作對照。接菌方法同1.3。

校正死亡率=[（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）]×100%。

2結果與分析

2.1玫煙色棒束孢不同菌株分生孢子的耐熱性

玫煙色棒束孢不同菌株分生孢子耐熱性測定結果如表 1。由表1可知，各菌株分生孢子的存活率差異極顯著，供試的IF14、IF502、IF511、IF609、IF7606、IF904、IF9606菌株殘存活孢率分別為35.00%、52.31%、36.00%、34.72%、28.70%、51.69%、57.28%，其中IF502、IF904和IF9606菌株熱脅迫后孢子存活率均達50%以上，表明它們具有較強的耐熱性;菌株IF14、IF511和IF609孢子存活率為 3472%～36.00%，耐熱性居中;而IF7606菌株孢子存活率僅為28.70%，耐熱性較差;而對照組的孢子存活率雖然各菌株間也存在顯著差異，但均在7932%以上。由此可見，同一菌種不同菌株對高溫的耐受性存在較大的差異。

2.2玫煙色棒束孢不同耐熱性菌株對麥長管蚜的毒力

不同耐熱性菌株對麥長管蚜的毒力如表2所示。由表可知，不同菌株隨著作用時間的延長對麥長管蚜的致病力存在差異。處理1 d后，麥長管蚜開始出現(xiàn)死亡，但死亡率較低，耐熱性居中的菌株IF14和耐熱性最強的IF9606菌株對麥長管蚜的致病力差異顯著。處理2 d后，各供試菌株對麥長管蚜的致病力顯著增強，耐熱性較強的IF904菌株表現(xiàn)出較好的毒力效果，累積校正死亡率高達58.33%，與其他菌株的致病力差異顯著，耐熱性最強的IF9606菌株和耐熱性居中的IF14菌株對麥長管蚜的致病力無明顯差異，累計校正死亡率均為33.33%。隨著作用時間的延長，不同菌株對麥長管蚜的累積死亡率逐漸增加，各供試菌株的毒力差異顯著，LT50的變化范圍是2.67～3.26 d。在接菌5 d時，各供試菌株的累積校正死亡率變化范圍是66.67%～88.20%，耐熱性較強的IF904菌株累積校正死亡率最高，為88.20%，與其他菌株對麥長管蚜的致病力差異顯著。測定結果顯示：作用同樣的時間后，耐熱性較強的IF904菌株與其他菌株相比，累積死亡率最高且致死中時最短。

2.3玫煙色棒束孢IF904對麥長管蚜的致死率

不同濃度的玫煙色棒束孢IF904菌株孢子懸浮液對麥長管蚜的毒力如表3所示。隨著孢子濃度的升高，麥長管蚜的累計校正死亡率也升高。說明玫煙色棒束孢IF904菌株對麥長管蚜的毒力效果隨著孢子濃度的升高而增強。當濃度從1×104提高到1×105個/mL后，麥長管蚜校正死亡率增長速率變緩;當濃度達到1×107個/mL時，校正死亡率達到88.20%。菌株IF904對麥長管蚜的致死中濃度（LC50）為4.26×105個/mL，95%置信區(qū)間為1.93×105～9.42×105個/mL。

3討論

環(huán)境溫度不僅會影響蟲生真菌的致病力、侵染速率、真菌病害的流行及殺蟲效果[1113]，而且對真菌殺蟲制劑的貯存穩(wěn)定性也有很大的影響[14]。目前，真菌殺蟲劑面臨常溫貨架期偏短、田間穩(wěn)定性較差等問題，特別是夏季高溫往往會超過生防真菌的適溫上限，在很大程度上影響生防真菌的使用效果。因此，耐熱生防真菌對于提高田間適用性和常溫貯藏時間具有十分重要的意義。本試驗采用48℃恒溫水浴45 min作為熱脅迫條件，對實驗室保存的7株玫煙色棒束孢進行了耐熱性篩選，供試菌株明顯分為耐熱性強、中、弱三類，較好地揭示了該菌的耐熱性變化范圍，這對玫煙色棒束孢不同菌株菌劑貯存期穩(wěn)定性的評價提供了理論依據。

毒力是衡量生防微生物菌種或菌株應用潛力的重要指標，也是篩選優(yōu)良生防菌株的基本依據。在相同孢子濃度和相同的溫、濕度條件下，篩選獲得的耐熱性不同的玫煙色棒束孢菌株對麥長管蚜均有一定的致病力，不同耐熱性菌株侵染致病效果不同且差異明顯。

耐熱性較強的玫煙色棒束孢IF904菌株

在較高濃度（1×107個/mL） 時和較低濃度（1×106個/mL）時，

均表現(xiàn)出一定的致病力，且累積校正死亡率隨著孢子濃度的增加而升高。這與黃建華等[15]研究玫煙色棒束孢對小菜蛾致病力的研究結果相似。表明玫煙色棒束孢IF904菌株是一株很有應用潛力的生防菌株。

參考文獻

[1]FENG M G， POPRAWSKI T J， KHACHATOURIANS G G. Production， formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control： current status [J]. Biocontrol Science and Technology，1994， 4（1）： 334.

[2]TANADA Y， KAYA H K. Insect pathology [M]. New York： Academic Press，1993：569.

[3]MCCLATCHIE G V， MOORE D， BATEMAN R P， et al. Effect of temperature on the viability of the conidia of Metarhizium flavoviride in oil formulations [J]. Mycological Research， 1994，98（7）： 749756.

[4]李娟，吳圣勇，王曉青，等.防治西花薊馬的球孢白僵菌菌株篩選及耐熱性測定[J].中國生物防治學報，2015，31（6）：845852.

[5]俞佳，馮明光.基于分生孢子熱脅迫反應的球孢白僵菌耐熱菌株篩選[J].菌物學報，2006，25（2）：278283.

[6]蒲蟄龍，李增智.昆蟲病原真菌學[M].合肥：安徽科學技術出版社，1996.

[7]張仙紅，李文英，賀運春.影響蟲生真菌玫煙色擬青霉孢子萌發(fā)的因素探析[J].中國農學通報，2007，23（7）：478481.

[8]田晶，李雅，刁紅亮，等.環(huán)境因子對玫煙色棒束孢IF1106菌株孢子萌發(fā)的影響[J].天津農業(yè)科學，2016，22（4）：812.

[9]張偉，呂利華，何余容，等.玫煙色棒束孢與短期35℃高溫對小菜蛾3齡幼蟲的聯(lián)合作用[J].環(huán)境昆蟲學報，2013，35（2）：182189.

[10]王成樹，王四寶，樊美珍，等.球孢白僵菌菌株耐熱力與貯藏穩(wěn)定性的關系[J].中國生物防治，1999，15（4）：162165.

[11]馮明光，應盛華.不同含水量和溫度下貯存中球孢白僵菌分生孢子活力與內貯營養(yǎng)的衰變[J].應用生態(tài)學報，2002，13（4）：439443.

[12]HALLSWORTH J E， MAGAN N.Water and temperature relations of growth of the entomogenous fungi Beauveria bassiana，Metarhizium anisopliae，and Paecilomyces farinosus [J]. Journal of Invertebrate Pathology， 1999，74：261266.

[13]INGLIS G D， JOHNSON D L， GOETTEL M S.Effects of temperature and sunlight on mycosis of Beauveria bassiana （Hyphomycetes： Sympodulosporae） of grasshoppers under field conditions [J]. Environmental Entomology， 1997，26：400409.

[14]LORD J C. Low humidity， moderate temperature and desiccant dust favor efficacy of Beauveria bassiana （Hyphomycetes：Moniliales） for the lesser grain borer， Rhyzopertha dominica （Coleoptera： Bruchidae） [J]. Biological Control， 2005，34： 180186.

[15]黃建華，羅任華，秦文婧，等.玫煙色棒束孢對小菜蛾的致病力[J].江西農業(yè)學報，2012，24（10）：6264.

（責任編輯：楊明麗）