重慶潼南朱砂葉螨田間抗性監(jiān)測(cè)及其抗性機(jī)制分析

王保軍 胡云鵬 申光茂 劉懷

1.5代謝酶基因表達(dá)檢測(cè)

朱砂葉螨RNA提取、基因組DNA去除、反轉(zhuǎn)錄等步驟均按照相應(yīng)試劑盒說明書操作并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)6個(gè)P450基因，4個(gè)GST基因以及4個(gè)CarE基因在田間種群和室內(nèi)敏感種群之間的表達(dá)差異，引物信息見表1。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用 SYBR Green法檢測(cè)，以RSP18為內(nèi)參基因。反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃ 預(yù)變性15 s;95℃變性 15 s，60℃退火加延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)體系為 20 μL，包括：2×SYBR master mix 10 μL、cDNA模板1 μL、上下游特異性引物各0.5 μL、無菌去離子水8 μL。所有試驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)有2個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[16]。并用 SPSS 16.0 軟件進(jìn)行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1抗藥性測(cè)定結(jié)果

阿維菌素和丁氟螨酯對(duì)朱砂葉螨潼南種群的毒力最高，LC50分別為0.879 mg/L和2.19 mg/L，甲氰菊酯效果最差，LC50為8 014.9 mg/L。與室內(nèi)敏感種群相比，朱砂葉螨潼南種群對(duì)田間施用較多的聯(lián)苯肼酯和噠螨靈已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的抗藥性，抗性倍數(shù)分別為敏感種群的55.8倍和32.0倍，對(duì)阿維菌素、丁氟螨酯和甲氰菊酯表現(xiàn)為低水平抗性。

2.2代謝酶活性檢測(cè)結(jié)果

為明確潼南田間種群對(duì)殺螨劑產(chǎn)生抗性的機(jī)制，對(duì)外源有毒物質(zhì)代謝的3種重要解毒代謝酶P450、GST、CarE的活性進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)田間種群P450、GST的活性均顯著高于室內(nèi)敏感種群，CarE活性雖比敏感種群高，但是未達(dá)到顯著水平（表3）。該結(jié)果表明田間種群對(duì)聯(lián)苯肼酯和噠螨靈抗藥性的提高可能是由于其體內(nèi)P450和GST活性升高所致。

2.3代謝酶基因表達(dá)差異分析

2.3.1P450相關(guān)基因表達(dá)差異

與P450活性相關(guān)的基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。其中CPR在P450酶系中起著傳遞電子的作用，是影響整個(gè)P450酶系功能的關(guān)鍵因子，通過檢測(cè)該基因的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，CPR基因在田間種群中的表達(dá)量為敏感種群的1.53倍，且差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。這一結(jié)果與P450活性檢測(cè)結(jié)果相符，表明P450活性的改變可能與其對(duì)聯(lián)苯肼酯和噠螨靈產(chǎn)生抗性有關(guān)。進(jìn)一步分析P450基因的表達(dá)量也發(fā)現(xiàn)田間種群的CYP392A28、CYP392A26、CYP384A1三個(gè)基因的表達(dá)量顯著提高，其中CYP392A28的變化最為明顯，比敏感種群上調(diào)了51.7倍，CYP392A26和CYP384A1則分別上調(diào)了2.75和2.41倍。另外兩個(gè)基因CYP389B1和CYP391A1的相對(duì)表達(dá)量雖然在田間種群中也有一定程度的提高，但是沒有達(dá)到顯著水平，推測(cè)它們?cè)谶@兩種藥劑的代謝過程中所起的作用有限。

2.3.2GST相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)

與GST活性相關(guān)的基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。Mu家族的兩個(gè)GST基因，GSTM7和GSTM9的相對(duì)表達(dá)量在田間種群中均顯著提高，分別為敏感種群的10.96和4.03倍，且GSTM9具有很高的表達(dá)量，表明該基因可能在聯(lián)苯肼酯和噠螨靈的代謝過程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，Delta家族的GSTD1基因在田間種群的表達(dá)量與敏感種群之間也存在顯著性差異，上調(diào)了1.59倍，而同家族GSTD2基因的相對(duì)表達(dá)量反而在田間種群中出現(xiàn)了顯著的降低，僅為敏感種群的0.522倍，表明Delta家族的GST在抗性形成的過程中可能存在不同的分工。

2.3.3CarE相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)

與CarE活性相關(guān)的基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。CarE13和CarE23的相對(duì)表達(dá)量在田間種群和敏感種群中基本相同，沒有顯著性差異，與CarE活性檢測(cè)結(jié)果一致。而CarE4和CarE6的相對(duì)表達(dá)量雖然在田間種群中出現(xiàn)了一定程度的提高，分別為敏感種群的1.80和5.39倍，但由于這兩個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量均較低，推測(cè)它們對(duì)CarE活性的影響有限。

3結(jié)論與討論

本研究通過生物測(cè)定明確了朱砂葉螨潼南田間種群對(duì)5種常用殺蟲殺螨劑的敏感性，從LC50來看，阿維菌素和丁氟螨酯對(duì)該螨均有很好的防治效果，并且和室內(nèi)敏感種群相比，田間種群對(duì)這兩種藥劑還沒有產(chǎn)生明顯的抗性。阿維菌素雖然已有較長(zhǎng)的使用歷史，但一直具有出色的殺螨活性，田間抗性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示朱砂葉螨還未對(duì)其產(chǎn)生明顯的抗藥性[17]。丁氟螨酯是一種新開發(fā)的高效殺螨劑，2013年在我國(guó)登記上市。雖然在歐洲已監(jiān)測(cè)到田間二斑葉螨逐漸對(duì)丁氟螨酯產(chǎn)生抗藥性[18]，但國(guó)內(nèi)目前還暫未有田間朱砂葉螨對(duì)其產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道。本次抗性檢測(cè)的結(jié)果也表明這兩種藥劑可以作為優(yōu)良的替代或輪換藥劑用于潼南田間朱砂葉螨的防治。

聯(lián)苯肼酯和噠螨靈是現(xiàn)階段田間常用的專性殺螨劑。但生測(cè)結(jié)果顯示潼南田間朱砂葉螨已對(duì)這兩種殺螨劑產(chǎn)生了中等水平的抗藥性，在防控中有必要選用其他作用機(jī)制不同的藥劑進(jìn)行輪換替代，以避免當(dāng)?shù)厝~螨種群抗性的進(jìn)一步發(fā)展。此外，雖然田間也時(shí)常使用菊酯類藥劑防治螨類，然而從甲氰菊酯對(duì)朱砂葉螨的LC50來看，效果并不理想。另有研究數(shù)據(jù)也表明亞致死劑量的菊酯類藥劑可能還具有使葉螨生殖力增強(qiáng)的作用，因此不推薦使用菊酯類藥劑開展害螨防治[19]。

有害生物可以通過提高體內(nèi)解毒代謝酶活性來提高其對(duì)藥劑的代謝速度，這是田間種群對(duì)藥劑產(chǎn)生低、中抗性的主要原因[2021]。由于抗性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示朱砂葉螨田間種群對(duì)這幾種藥劑的抗性還未達(dá)到高抗水平，因此本研究選擇從代謝抗性角度分析可能參與相關(guān)藥劑代謝的酶和基因。通過檢測(cè)代謝酶活性發(fā)現(xiàn)，朱砂葉螨田間種群體內(nèi)P450和GST的活性顯著高于室內(nèi)敏感種群，而CarE活性則沒有顯著性差異，表明P450和GST活性的提高可能與其能夠及時(shí)代謝聯(lián)苯肼酯或噠螨靈有關(guān)。而相關(guān)基因表達(dá)差異的結(jié)果則顯示田間種群的CYP392A28、CYP392A26、CYP384A1以及GSTM7和GSTM9等基因的表達(dá)量均有顯著提高，表明它們是蛋白水平酶活性增強(qiáng)的主要原因。雖然目前關(guān)于朱砂葉螨對(duì)聯(lián)苯肼酯和噠螨靈的抗性機(jī)制還鮮有報(bào)道，但在柑橘全爪螨Panonychus citri的研究中，Ding等[22]發(fā)現(xiàn)經(jīng)噠螨靈脅迫后，柑橘全爪螨體內(nèi)P450和GST活性會(huì)明顯提高，并且有多個(gè)P450基因?qū)}螨靈的藥劑處理表現(xiàn)出應(yīng)激性表達(dá)現(xiàn)象，而CarE的活性在藥劑脅迫前后沒有顯著性差異。這與本研究的結(jié)果一致，證明朱砂葉螨對(duì)噠螨靈等專性殺螨劑的代謝抗性極有可能是由于P450和GST基因過表達(dá)，進(jìn)而在蛋白水平引起酶活性的提高，增強(qiáng)了害螨對(duì)殺螨劑的代謝能力導(dǎo)致的。

綜上所述，本研究通過抗藥性監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)潼南朱砂葉螨田間種群對(duì)常用的殺螨劑聯(lián)苯肼酯和噠螨靈均產(chǎn)生了較高的抗藥性。甲氰菊酯的殺螨活性不高，阿維菌素和丁氟螨酯則具有較好的殺螨效果，可以作為替代藥劑使用。代謝酶活性以及基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明P450和GST可能協(xié)同參與了聯(lián)苯肼酯和噠螨靈的代謝過程，其中CYP392A28和GSTM9這兩個(gè)基因的作用可能最明顯，而CarE在此過程中所起的作用有限。

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（責(zé)任編輯：田喆）