紫甘藍(lán)矢車菊色素苷的分析及其苷元的制備

蔣曉嵐，石渝鳳，付周平，成 琳，劉亞軍，高麗萍，夏 濤,*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036）

花青素是一類廣泛存在于植物中的天然色素，如紫甘藍(lán)、紫薯、葡萄、玫瑰花、藍(lán)莓、茄子等[1]?；ㄇ嗨貙儆陬慄S酮化合物，其基本結(jié)構(gòu)如圖1所示，由于取代基的不同，可形成多種花青素，如天竺葵色素、飛燕草色素、矢車菊色素等。游離態(tài)的花青素單體在自然條件下非常少見，經(jīng)常與各種單糖通過糖苷鍵連接形成花青素糖苷?；ㄇ嗨靥擒罩械牧u基還可以與一個(gè)或多個(gè)分子的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等通過酯鍵形成?；幕ㄉ誟1-2]。

圖1 花青素基本結(jié)構(gòu)Fig. 1 Basic structure of anthocyanins

花青素類色素具有顯著的抗氧化活性[3-5]，還具有抗菌、抗衰老、降低癌癥和心血管疾病發(fā)病率等重要生理功能[6-10]。基于花青素的這些生理活性，花青素相關(guān)研究主要集中在對(duì)花青素苷提取純化的研究[1,10-16]、花青素理化性質(zhì)及穩(wěn)定性的研究[3,5,17]、花青素產(chǎn)品的應(yīng)用及開發(fā)以及花青素合成代謝的調(diào)控[18-20]等，其中對(duì)花青素苷的提取純化是其他花青素研究的基礎(chǔ)。

食用蔬菜紫甘藍(lán)來源豐富，色素含量很高，相關(guān)研究報(bào)道花青素的穩(wěn)定性，以及花青素作為酸堿指示劑的特性[21-22]。同其他花青苷類色素一樣，紫甘藍(lán)色素具有很強(qiáng)的抗氧化能力，以及預(yù)防心腦血管疾病等功效[3-4,23-24]，具有很高的研究?jī)r(jià)值。液相色譜-質(zhì)譜法分析表明，紫甘藍(lán)花青素中含有多種花色苷，基本為矢車菊色素的一系列糖苷及其酰化物[1-2,5,25-26]。紫甘藍(lán)中花青素苷的提取純化技術(shù)已基本成熟，相關(guān)研究表明大孔樹脂柱、Sephadex LH-20凝膠層析柱等對(duì)紫甘藍(lán)花青素具有較好的純化效果[11,27-28]。但有關(guān)制備高純度花青素苷元的方法報(bào)道較少。花青素苷元作為花青素苷以及兒茶素類合成的前體，在研究黃酮類生物合成代謝調(diào)控中，作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，必不可少。但是花青素苷元價(jià)格昂貴，例如矢車菊色素，現(xiàn)在市售95%純度的矢車菊色素單體為842.4 元/mg，利用低成本制取高純度的矢車菊色素苷元具有很大的市場(chǎng)前景。

本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，首先對(duì)紫甘藍(lán)花青素苷進(jìn)行定性分析，鑒定紫甘藍(lán)中的矢車菊色素苷；然后對(duì)矢車菊色素苷的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用AB-8型大孔樹脂對(duì)矢車菊色素苷進(jìn)行初步純化后，通過高溫酸水解的方法獲得游離態(tài)矢車菊色素粗品；再利用C18柱層析的方法純化得到矢車菊色素單體；最后通過結(jié)晶沉淀的方法獲得純度大于99%矢車菊色素單體粉末，從而為后續(xù)的科學(xué)研究提供特定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘藍(lán)購(gòu)于合肥清溪路大潤(rùn)發(fā)超市，清洗后去除老葉受損的葉子，置于冰箱中保存。

甲醇、乙腈、乙酸（均為色譜純） 美國(guó)Tedia公司；無水乙醇、甲醇（均為分析純），濃鹽酸 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；AB-8型大孔樹脂 安徽良臣硅源材料有限公司；C18柱填料 GE醫(yī)療生命科學(xué)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ANKE TGL-16C臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ZK高速自控組織搗碎機(jī) 江蘇省鹽城縣龍崗醫(yī)療機(jī)械廠；AR124CN電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；UV-265型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；20AD高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；HH-2恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；YCYN-DCY-24Y圓形氮吹儀 上海鄆曹電子科技有限公司；超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra pressure liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）、20RBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；Synergi 4u Fusion色譜柱（250 mm×4.6 mm） 美國(guó)Phenomenex公司；AVANCE AV 400（400/100 MHz）核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 紫甘藍(lán)花青素苷的分析鑒定

1.3.1.1 紫甘藍(lán)花青素苷的提取

稱取0.1 g紫甘藍(lán)置于研缽中，加入含50%乙醇-1%鹽酸溶液1 mL作為提取溶液，進(jìn)行研磨提取，離心取上清液。重復(fù)上述步驟2 次，合并上清液，定容至2 mL，備用。

1.3.1.2 紫甘藍(lán)花青素苷最大吸收波長(zhǎng)的確定

將獲得的紫甘藍(lán)花青素苷溶液稀釋后，以蒸餾水作為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)在400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行吸光度測(cè)定，從而確定最大吸收波長(zhǎng)，并在最大波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)因素的吸光度，探討各因素對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取純化的影響。

1.3.1.3 紫甘藍(lán)花青素苷的鑒定

色譜條件：流速0.2 mL/min，柱溫箱40 ℃。流動(dòng)相為0.4%乙酸溶液（A相），100%乙腈（B相）；線性洗脫梯度為：0～10 min，10%～30% B，1 0～1 5 m i n，3 0%～3 5% B；1 5～1 8 m i n，35%～10% B，回到起始比例。

質(zhì)譜條件：正、負(fù)離子模式，電子電離源，碎裂電壓175 V，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～2 000，毛細(xì)管電壓3 500 V，干燥氣流速6 L/min，干燥氣溫度350 ℃，噴霧器電壓45 psi。

通過UPLC-MS/MS保留時(shí)間、最大吸收波長(zhǎng)、質(zhì)子化/去質(zhì)子化分子（[M+H]+/[M－H]－），以及主要的碎片離子，與標(biāo)準(zhǔn)品及文獻(xiàn)進(jìn)行比較分析，對(duì)化合物進(jìn)行鑒定。

1.3.2 矢車菊花青素苷提取工藝的優(yōu)化

分別稱取0.1 g紫甘藍(lán)葉片放入研缽中，按不同料液比，加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液和鹽酸搗碎至勻漿?？疾焯崛∫褐幸掖俭w積分?jǐn)?shù)（20%、30%、40%、50%、60%、70%）、鹽酸體積分?jǐn)?shù)（0.5%、1%、2%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL））因素對(duì)矢車菊色素苷提取效果的影響，確定最佳提取工藝。

1.3.3 矢車菊花青素苷的初步純化

在最佳提取條件下，用組織搗碎機(jī)提取約1.152 kg紫甘藍(lán)中的矢車菊色素苷，抽濾后備用。AB-8型大孔樹脂填料用無水乙醇浸泡過夜，倒入層析柱中，然后用2～3 倍無水乙醇清洗，再用3～5 倍柱體積的純水洗至流出液無醇味。將提取的矢車菊色素苷初提液稀釋至乙醇體積分?jǐn)?shù)約為10%時(shí)上柱，待矢車菊色素苷全部被吸附后，再用3～5 倍柱體積的純水沖洗；用10%、20%、30%、40%、50%乙醇溶液依次洗脫，收集各洗脫液。

1.3.4 矢車菊花青素苷的酸解

由于矢車菊色素苷屬糖苷化合物，而糖苷化合物在含1%～7%鹽酸體積分?jǐn)?shù)的洗脫液中，高溫下會(huì)水解成相應(yīng)的苷元和糖配體。收集初步純化的矢車菊色素苷，按4∶1比例與濃鹽酸混合配成水解溶液，置于90 ℃恒溫水浴箱中水解1 h，得到矢車菊花青素苷水解后的溶液。

1.3.5 矢車菊色素的C18柱純化

將矢車菊色素純度最高的組分上C18柱，吸附后分別用3 倍柱體積的30%、50%和70%甲醇溶液洗脫，收集不同的洗脫液，HPLC分析其純度。

1.3.6 矢車菊色素結(jié)晶

將上述得到的高純度矢車菊色素，用純水稀釋到甲醇體積分?jǐn)?shù)為10%左右，再用大孔樹脂吸附，然后用100%甲醇洗脫進(jìn)行濃縮。濃縮液在通風(fēng)廚中揮發(fā)，除去部分甲醇，按體積比5∶1加入濃鹽酸，－20 ℃冷凍一段時(shí)間后即出現(xiàn)大量析出的紫紅色沉淀。得到的沉淀離心后用氮吹儀吹干，得到矢車菊色素純品粉末。

1.3.7 矢車菊色素HPLC分析

HPLC條件：檢測(cè)波長(zhǎng)為530 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。采用梯度洗脫，條件為A相1%乙酸，B相乙腈，洗脫梯度為0～30 min，87%～70% A相；30～33 min，70%～87% A相。

1.3.8 矢車菊色素1H-NMR分析

將得到的矢車菊色素苷元粉末溶于氘代甲醇（CD3OD），然后轉(zhuǎn)移到5 mm直徑的核磁管中，用H-NMR儀在反轉(zhuǎn)門控去偶條件下，脈沖角度為45°，收集時(shí)間為0.4 s，延遲時(shí)間為2.6 s，掃描頻率為25 000～30 000 Hz進(jìn)行1H-NMR分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖像處理

提取條件的優(yōu)化，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，然后取平均值。HPLC及質(zhì)譜圖分析，經(jīng)Adobe Photoshop CS5軟件進(jìn)一步處理。最后所得矢車菊色素純品，其得率計(jì)算：得率=純品質(zhì)量/紫甘藍(lán)質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘藍(lán)花青素苷的分析鑒定結(jié)果

2.1.1 紫甘藍(lán)花青素最大吸收波長(zhǎng)的確定

花青素色素類在520～600 nm波長(zhǎng)之間有一明顯的最大吸收峰。從圖2可知，紫甘藍(lán)花青素的最大吸收峰是在520～530 nm波長(zhǎng)處，因此本實(shí)驗(yàn)于波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定各吸光度，探討各種實(shí)驗(yàn)條件對(duì)紫甘藍(lán)色素提取純化的影響。

圖2 花青素紫外吸收光譜Fig. 2 Ultraviolet absorption spectrum of anthocyanins from purple cabbage

2.1.2 紫甘藍(lán)花青素苷的鑒定

利用UPLC-MS/MS對(duì)紫甘藍(lán)花青素苷提取物進(jìn)行定性分析，由圖3A和3B可知，530 nm波長(zhǎng)處液相色譜圖和總離子流圖相一致，且在正離子模式下，花青素苷類化合物的離子化效果很好。根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜離子和二級(jí)質(zhì)譜碎片離子，以及保留時(shí)間等信息（圖2C），獲得化合物的分子質(zhì)量信息，分析每個(gè)譜峰，確定可能的分子質(zhì)量，并與文獻(xiàn)報(bào)道的成分進(jìn)行比較，推測(cè)色譜峰的可能組成。

峰1在正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜m/z 773，二級(jí)質(zhì)譜m/z 611、449和287（圖3C和表1）。其中二級(jí)質(zhì)譜中的信號(hào)m/z 611、449和287分別是m/z 773失去1、2 個(gè)和3 個(gè)葡萄糖基（質(zhì)量數(shù)162）所得，根據(jù)文獻(xiàn)[1,2,5]，峰1預(yù)測(cè)為矢車菊-3-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷。峰4和峰12，正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜m/z 979，二級(jí)質(zhì)譜m/z 817、449和287（圖3C和表1），其中二級(jí)質(zhì)譜中的信號(hào)m/z 817是母離子m/z 979失去1個(gè)葡萄糖基（質(zhì)量數(shù)162）所得，m/z 449是母離子m/z 979失去質(zhì)量數(shù)530所得，推測(cè)為2 個(gè)葡萄糖基和1 個(gè)芥子?；鶕?jù)文獻(xiàn)[1,2,5]，峰4和峰12預(yù)測(cè)為矢車菊-3-(芥子酰基)-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷。峰16在正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜m/z 1 185，二級(jí)質(zhì)譜為m/z 1 023、449和287（圖3C和表1），其中二級(jí)質(zhì)譜中的信號(hào)m/z 1 023，是母離子m/z 1 185失去1 個(gè)葡萄糖基（質(zhì)量數(shù)162）所得，m/z 449是母離子m/z 1 185失去質(zhì)量數(shù)736所得，推測(cè)為2 個(gè)葡萄糖基和2個(gè)芥子?；?，根據(jù)文獻(xiàn)[1,2,5]，峰16預(yù)測(cè)為矢車菊-3-(芥子?；?(芥子?；?-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷。

圖3 紫甘藍(lán)中花色苷的鑒定Fig. 3 Identification of anthocyanins of purple cabbage

按照上述方法，從紫甘藍(lán)中分析鑒定16 種花色苷類化合物（表1），主要為B環(huán)二羥基的矢車菊類花色苷。紫甘藍(lán)中花色苷主要為?；问?，更有利于花色苷的穩(wěn)定，?；饔玫乃嵊衟-香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、琥珀酸和芥子酸等。?；奶擎湆⒄郫B好的?；p繞在2-苯基苯并吡喃骨架的表面，此堆積作用不僅對(duì)花色苷具有保護(hù)作用，而且對(duì)系統(tǒng)的色澤穩(wěn)定性具有積極的作用[29]。

表1 通過UPLC-MS MS鑒定紫甘藍(lán)中花青素Table 1 Identifified anthocyanin from purple cabbage via UPLC-MS MS

2.2 紫甘藍(lán)花青素苷元的制備與純化結(jié)果

2.2.1 矢車菊色素苷提取工藝的優(yōu)化結(jié)果

研究結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～60%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，對(duì)矢車菊色素苷提取效果越來越好；乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，不利于紫甘藍(lán)矢車菊色素苷的提取。本著經(jīng)濟(jì)原則以及后續(xù)純化的方便，選擇體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液（圖4A）。根據(jù)文獻(xiàn)[21-22]，酸性溶液環(huán)境有助于提高花青素的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)向提取溶液中加入少量鹽酸，能夠顯著提高提取效果。然而過多鹽酸會(huì)使溶液酸度過大，在后續(xù)的柱層析純化過程中，影響柱填料的性能，因此結(jié)合文獻(xiàn)，最終選擇含1%鹽酸的乙醇溶液作為提取液（圖4B）。由圖4C顯示，隨提取試劑的增加，提取效果無明顯差別，考慮經(jīng)濟(jì)成本以及對(duì)環(huán)境的影響，選擇1∶10（g/mL）作為提取紫甘藍(lán)矢車菊色素苷的料液比。

圖4 不同提取條件對(duì)矢車菊色素苷提取效果的影響Fig. 4 Effect of extraction concentrations on the yield of cyanidins

2.2.2 矢車菊色素苷的初步純化結(jié)果

矢車菊色素苷粗提液用大孔樹脂吸附后，經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇梯度洗脫，結(jié)果顯示40%乙醇溶液洗脫后得到的組分顏色最深，呈紫紅色，可知40%乙醇溶液洗脫時(shí)得到的矢車菊色素苷的含量最高（圖5A）。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)表明，5 組吸光度分別為0.133、0.278、0.468、0.524、0.453，可知40%乙醇溶液洗脫時(shí)，其吸光度最大（圖5B）。

圖5 AB-8大孔樹脂純化紫甘藍(lán)矢車菊色素苷效果Fig. 5 Purification efficiency of cyanidins with macroporous resin AB-8

2.2.3 矢車菊色素的制備與純化

圖6 經(jīng)C18純化后的矢車菊色素HHPPLLCC圖Fig. 6 HPLCprofiles of cyanidins puri fied with C18

收集初步純化后的矢車菊色素苷溶液，水解去除糖配體后，再經(jīng)C18柱純化。用C18柱純化時(shí)，分別依次用30%、50%、70%甲醇溶液洗脫，收集各洗脫液并進(jìn)行HPLC分析。由圖6A可知，矢車菊色素的出峰時(shí)間約為12.5 min，其中30%甲醇洗脫液時(shí)，矢車菊色素主峰前仍有雜質(zhì)峰（圖6B），推測(cè)是未水解的矢車菊色素苷。70%甲醇洗脫液時(shí)，在矢車菊色素主峰后，有雜質(zhì)峰，可能是水解過程中氧化變性的花青素（圖6D）。而50%甲醇洗脫液顯示除矢車菊色素峰外，幾乎無雜峰，說明經(jīng)C18柱純化后，50%甲醇洗脫液中含有高純度的矢車菊色素單體，其純度可達(dá)到98%（圖6C）。

2.2.4 矢車菊色素結(jié)晶

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)最后純化得到矢車菊色素純品粉末約100 mg，計(jì)算得率為86.806 mg/kg。1H-NMR分析表明，得到的純品粉末為矢車菊色素（圖7A）。HPLC二維以及三維圖譜分析表明，結(jié)晶后的矢車菊色素純度大于99%（圖7B、C）。光譜分析表明，矢車菊色素最大吸收波長(zhǎng)為524 nm（圖7D），質(zhì)譜分析表明，正離子模式下矢車菊色素m/z 287（圖7E）。

圖7 結(jié)晶沉淀后純化的矢車菊色素特性Fig. 7 Properties of cyanidin monomer powder after crystallization

3 結(jié) 論

通過UPLC-MS/MS對(duì)紫甘藍(lán)中花色苷進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)紫甘藍(lán)中花色苷主要是B環(huán)二羥基的矢車菊色素的衍生物。在此基礎(chǔ)上，對(duì)紫甘藍(lán)中花色苷和矢車菊色素進(jìn)行純化。首先，以提取劑體積分?jǐn)?shù)、鹽酸體積分?jǐn)?shù)、料液比為考慮因素，分別對(duì)紫甘藍(lán)中的色素提取條件進(jìn)行探索，通過單因素試驗(yàn)得出紫甘藍(lán)矢車菊色素苷的最佳提取條件為：含1%鹽酸的50%乙醇溶液作為提取溶劑、料液比1∶10（g/mL）。經(jīng)過AB-8大孔樹脂以及C18純化后，結(jié)晶得到比較純的矢車菊色素。經(jīng)HPLC分析，純度達(dá)99%以上。1.152 kg紫甘藍(lán)獲得100 mg矢車菊色素純品粉末，得率為86.806 mg/kg。