副溶血性弧菌廣譜裂解性噬菌體的篩選及其在海產(chǎn)品安全控制中的應(yīng)用

鄭小雙 ，高 璐,2，張 輝，饒勝其,2，楊振泉,2,*

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，江蘇 南京 210014）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是引起海產(chǎn)品食物中毒的主要病原菌[1-2]。該菌為嗜鹽菌，主要分布于海洋動(dòng)物的表面組織、海底沉積物及海水中[3-4]，因此在海產(chǎn)食品中此菌檢出率很高。食用被該菌污染的海產(chǎn)品后，極易引起急性腸胃炎[5]和敗血癥[6]，隨著現(xiàn)代海產(chǎn)品貿(mào)易和物流配送體系的完善，海產(chǎn)品的消費(fèi)量逐年增加，該菌引發(fā)食源性致病菌的風(fēng) 險(xiǎn)和暴露人群也在不斷升高[7-8]。傳統(tǒng)的化學(xué)保鮮劑雖然具有良好的抑菌效果，但殘留高，不利于人體健康[9]。因此，開(kāi)發(fā)新型的高效、無(wú)毒、廉價(jià)的天然抑菌劑用于控制海產(chǎn)品養(yǎng)殖、加工、保藏過(guò)程中致病菌的載量，符合 人們對(duì)綠色產(chǎn)品的需求。噬菌體是細(xì)菌的病毒，能夠?qū)Ｒ恍缘亓呀馑拗骶?，作用機(jī)理明確，具有對(duì)人體和動(dòng)物安全等特點(diǎn)[10-11]。另一方面，噬菌體數(shù)量龐大[12]，易于篩選，成本低廉，十分適合用于海產(chǎn)品等易腐敗食品中主要病原菌的控制。

本研究以42 株不同來(lái)源致病性Vp為宿主菌，從江蘇省揚(yáng)州不同地點(diǎn)采集的污水樣品中分離裂解型噬菌體，分析其形態(tài)、裂解譜、p H值及溫度穩(wěn)定性、抗性突變頻率等生物學(xué)特征，并以人工污染的黃魚(yú)作為模型，研究多噬菌體混合物對(duì)模擬污染黃魚(yú)的抑菌效果，為開(kāi)發(fā)廣譜Vp噬菌體抑制劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：42 株Vp分離株均為本室分離并保存。

2216E液體、固體培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；TCBS瓊脂 杭州濱和微生物試劑有限公 司。

SM緩沖液：NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2 g，明膠0.1 g，50 mL的1 mol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5），蒸餾水定容1 000 mL，121 ℃滅菌備用；0.9%生理鹽水由本實(shí)驗(yàn)室自行配制，121 ℃滅菌備用。

1.2 儀器與設(shè)備

BDY-2012 恒溫?fù)u床 上海百典儀器設(shè)備有限公司；DGX-9053B-2型生化培養(yǎng)箱 上海?，斣O(shè)備有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DICO型臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tommy公司；Tecnai-12透射電鏡荷蘭Philips公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

將－70 ℃菌種保存液在4 ℃解凍后，取100 μL接種于5 mL 2216E液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)6 h后TCBS瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取單菌落接種于5 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)6 h，放置室溫備用。

1.3.2 樣品采集

45 份污水樣品采集自江蘇省揚(yáng)州市3 個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，置于無(wú)菌離心管，4 ℃保存?zhèn)溆?；新鮮黃魚(yú)購(gòu)自江蘇省揚(yáng)州市本地超市。

1.3.3 噬菌體的分離和純化

將污水樣品5 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液加入5 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，同時(shí)加入100 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vp宿主菌，37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h后5 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，濾液經(jīng)梯度稀釋后與宿主菌混合傾注雙層平板，37 ℃培養(yǎng)6～8 h檢測(cè)噬菌斑。挑取單個(gè)空斑至1 mL SM緩沖液中，4 ℃過(guò)夜，用SM緩沖液倍比稀釋噬菌體液，取適宜梯度加入宿主菌制成雙層平板，37 ℃培養(yǎng)6～8 h，重復(fù)培養(yǎng)5次，得到純噬菌體備用。

1.3.4 噬菌 體的電鏡觀察

參考文獻(xiàn)[13]，采用磷鎢酸負(fù)染色法。取20 μL噬菌體懸液（效價(jià)109PFU/mL）滴于復(fù)膜銅網(wǎng)上，吸附10 min后取出銅網(wǎng)，空氣中 自然干燥2～3 min；然后用2%的磷鎢酸溶液進(jìn)行染色，2 min后吸干水分，空氣干燥5 min，用Tecnai-12透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)。

1.3.5 裂解譜測(cè)定

應(yīng)用點(diǎn)斑法測(cè)定噬菌體的裂解譜[14]，取5 mL 2216E半固體培養(yǎng)基加入50 μL宿主菌（108CFU/mL），顛倒混勻后傾倒在固體培養(yǎng)基上，待凝固后，滴加噬菌體懸液（108PFU/mL）10 μL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～12 h，觀察裂解圈的形成。

1.3.6 噬菌體pH值和熱穩(wěn)定性測(cè)定

取100 μL 109PFU/mL的噬菌體液與pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的2216E培養(yǎng)基混合，37 ℃的水浴2 h，測(cè)定噬菌體的效價(jià)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。取0.5 mL的噬菌體（109PFU/mL），分別于50、60、70、80 ℃水浴作用20、40 min和60 min，作用結(jié)束后取樣，測(cè)定噬菌體的效價(jià)，每一溫度設(shè)3 個(gè)平行。取平均值用于分析噬菌體pH值和熱敏感性。

1.3.7 最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）測(cè)定

噬菌體懸液（109PFU/mL）梯度稀釋，與對(duì)數(shù)期的宿主菌液（108CFU/mL）按照MOI為0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100的比例混合，加入10 mL的2216E液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)6 h；取1 mL培養(yǎng)液8 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定噬菌體的效價(jià)，選擇效價(jià)最高的MOI為最佳MOI。

1.3.8 一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定

一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定采用Lu等[15]改進(jìn)的方法。將噬菌體懸液（109PFU/mL）與對(duì)數(shù)期宿主菌懸液（108CFU/mL）按照MOI大于 10的比例加入 到2216E液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫孵育10 min，12 000 r/min離心30 s，用2216E液體培養(yǎng)基洗滌沉淀3 次；然 后加入等體積預(yù)熱的2216E液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min振 蕩培養(yǎng)，每隔10 min取樣，測(cè)定噬菌體效價(jià)（lg（PFU/mL））。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、噬菌體效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線。裂解量按裂解末期噬菌體的效價(jià)與裂解初期宿主菌的濃度比值進(jìn)行計(jì)算。

1.3.9 噬菌體不敏感突變頻率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]所述方法測(cè)定噬菌體不敏感突變頻率（bacteriophage insensitive mutants frequency，BIMF）。分別取新鮮培養(yǎng)的Vp菌懸液（105CFU/mL）和相應(yīng)噬菌體懸液（108PFU/mL）各100 μL混合，混合噬菌體BIMF測(cè)定取5 株噬菌體（107PFU/mL）制成的混懸液（VppMIX）和相應(yīng)5 株宿主菌混合菌液（105CFU/mL）各100 μL混合，在混合體系中加入 CaCl2（0.01 mol/L）和MgSO4（0.01 mol/L），以不加噬菌體的Vp菌株作為對(duì)照，37 ℃靜置培養(yǎng)10 min，梯度稀釋后涂布TCBS平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h，計(jì)算平皿中噬菌體抗性菌落總數(shù)（假定不敏感菌落數(shù)）。挑取所有抗性菌落，接種于2216E液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)8 h，點(diǎn)斑法測(cè)定培養(yǎng)物對(duì)噬菌體的敏感性，計(jì)算沒(méi)有裂解圈的菌株總數(shù)（確定不敏感菌落數(shù)）。BIMF為確定的不敏感菌落數(shù)量與沒(méi)有添加噬菌體的菌落數(shù)比值。

1.3.10 噬菌體對(duì)黃魚(yú)中Vp的抑制作用

應(yīng)用模擬污染的黃魚(yú)肉作為模型測(cè)定噬菌體對(duì)海水魚(yú)基質(zhì)中Vp的抑制作用[17]。采集新鮮黃魚(yú)背部肌肉，切成2 cm×2 cm的小塊，先用次氯酸鈉浸泡15 min，撈出瀝干，無(wú)菌水漂洗5次，每次3 min，瀝干備用。將魚(yú)肉樣品分為4 個(gè)處理組（每組30 塊）：實(shí)驗(yàn)組1：噬菌體處理，MOI=10 000；實(shí)驗(yàn)組2：噬菌體處理，MOI=100；實(shí)驗(yàn)組3：噬菌體處理，MOI=1；對(duì)照組：空白，沒(méi)有噬菌體處理。

將5 種噬菌體液（109PFU/mL）等體積混合制成VppMIX，終體積為500 mL，梯度稀釋到107PFU/mL和105PFU/mL備用。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組魚(yú)塊先用Vp菌懸液（105CFU/mL）浸泡10 min，撈出瀝干；實(shí)驗(yàn)組1、2、3魚(yú)塊分別置于109、107、105PFU/mL噬菌體懸液中浸泡10 min，撈出瀝干，裝入聚乙烯薄膜袋中；將對(duì)照組魚(yú)塊置于等體積的生理鹽水中浸泡10 min，瀝干后裝入聚乙烯薄膜袋中。將所有魚(yú)塊放置25 ℃進(jìn)行恒溫貯藏。分別在0、2、4、6、8 、10、12、18、24 h取魚(yú)塊，均質(zhì)后，用生理鹽水梯度稀釋，涂布TCBS平板，37 ℃培養(yǎng)18 h，人工計(jì)數(shù)菌落總數(shù)（lg（CFU/mL）），每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，比較不同處理組的抑菌效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用S P S S 1 7.0軟件對(duì) 數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），P＜0.05，差異 顯著；并用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體分離純化

從揚(yáng)州市3 個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的45 份污水樣品，以42 株Vp菌株作為宿主菌，從其中10 份樣品中分離到15 株烈性噬菌體，噬菌斑裂解圈直徑在1～2 mm之間，存在清澈透明、渾濁、透明圈外有暈環(huán)等形態(tài)；篩選其中裂解圖清澈透明（圖1）5 株噬菌體（編號(hào)為VppYZU64、VppYZU68、VppYZU81、VppYZU92、VppYZU110）進(jìn)一步研究。

圖1 1 VpVp噬菌體的噬菌斑Fig. 1 Morphology of Vp phages plaques

2.2 噬菌體的微觀形態(tài)

圖2 2 VpVp噬菌體透射電鏡照片F(xiàn)ig. 2 Transmission electron micrographs of Vp phages

圖2透射電鏡結(jié)果顯示5 株噬菌體呈現(xiàn)不同的微觀形態(tài)。VppYZU64頭部呈長(zhǎng)多面體對(duì)稱，直徑約為90.9 nm，尾部長(zhǎng)約136.4 nm；VppYZU68頭部為正多面體結(jié)構(gòu)，直徑約為63.6 nm，尾部長(zhǎng)約115.2 nm；VppYZU92頭部為69.2 nm的正多面體結(jié)構(gòu)，有細(xì)長(zhǎng)而柔軟的尾部，長(zhǎng)度約為200 nm。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)第九次報(bào)告所提出的分類準(zhǔn)則[18]，這3 種噬菌體屬于長(zhǎng)尾噬菌體科（Siphoviridae）。VppYZU81頭部呈正多面體結(jié)構(gòu)，直徑約為55 nm，沒(méi)有尾部，屬于蓋噬菌體科（Corticoviridae）；VppYZU110頭部呈正多面體結(jié)構(gòu)，直徑約為87.1 nm，尾部 長(zhǎng)約93.1 nm，外圍有一個(gè)收縮性的尾鞘，屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae），結(jié)果顯示了Vp烈性噬菌體存在形態(tài)多樣性。

2.3 噬菌體的裂解譜

應(yīng)用點(diǎn)斑法測(cè)定5 株及其混合懸液噬菌體（VppMIX）對(duì)42 株Vp菌株的裂解譜（表1），結(jié)果顯示不同噬菌體分離株具有不同的裂解范圍。噬菌體VppYZU68能裂解5 個(gè)Vp菌株；VppYZU64能裂解17 個(gè)Vp菌株；VppYZU81可以裂解24 個(gè)Vp菌株；VppYZU92可以裂解10 個(gè)Vp菌株；VppYZU110能裂解23 個(gè)Vp菌株。5 株噬菌體混合物VppMIX裂解譜覆蓋了所有Vp菌株。噬菌體對(duì)Vp種內(nèi)菌株的裂解性與菌株來(lái)源和毒力基因型并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

表 11 VVpp噬菌體裂解譜Table 1 Lysis spectrum of Vp p haaggeess

2.4 pH值對(duì)噬菌體活性的影響

圖3 Vp噬菌體的pH值穩(wěn)定性Fig. 3 pH stability of Vp phages

如圖3所示，pH值對(duì)噬菌體的活性具有影響，5 株噬菌體在pH 4～10之間保持較高活性；當(dāng)pH值超過(guò)10時(shí)，效價(jià)均呈現(xiàn)不同程度下降。VppYZU64在pH 10～12時(shí)，效價(jià)下降了2.2（lg（PFU/mL））（圖3A）。VppYZU92在pH 9～12時(shí)，效價(jià)下降了2.0（lg（PFU/mL））（圖3D）；VppYZU110在pH值為12時(shí)，效價(jià)降到0（lg（PFU/mL））（圖3E），呈現(xiàn)較高的堿不穩(wěn)定性。所有噬菌體在pH值不大于3或大于13時(shí)，效價(jià)均為0。

2.5 溫度對(duì)噬菌體活性的影響

圖4結(jié)果顯示，所有噬菌體在50 ℃作用60 min效價(jià)保持不變；在60 ℃作用40 min以后，效價(jià)緩慢下降；在70 ℃作用，效價(jià)均急劇下降，其中VppYZU1 10在20 min后已經(jīng)完全失活（圖4E）；大多數(shù)噬菌體對(duì)80 ℃處理敏感，VppYZU68、VppYZU92在20 min后已測(cè)不出活性（圖4B、D），但VppYZU64和VppYZU81在80 ℃處理20 min時(shí)仍保持微弱活性（圖4A、C）。

圖4 噬菌體的熱穩(wěn)定性Fig. 4 Thermal stability of Vp phages

2.6 噬菌體的最佳MOI

以不同濃度（103～108PFU/mL）噬菌體感染Vp宿主菌（106CFU/mL），測(cè)定培養(yǎng)后噬菌體效價(jià)，測(cè)定的最佳MOI如表2所示。結(jié)果顯示：VppYZU64、VppYZU68、VppYZU81、VppYZU92、VppYZU110的最佳MOI分別為0.1、0.001、1、0.1、0.1。

表2 Vp噬菌體的最佳MOITable 2 Optimum MOI of Vp phages

2.7 噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線

圖5 5 VpVp噬菌體一步生長(zhǎng)曲線Fig. 5 One-step growth curve of Vp phages

如圖5所示，所有噬菌體的增值規(guī)律均呈典型的S型曲線，具有明顯的潛伏期、爆發(fā)期和平臺(tái)期。根據(jù)一步生長(zhǎng)曲線估算的噬菌體的潛伏時(shí)間、爆發(fā)時(shí)間和裂解量結(jié)果如表3所示，VppYZU64裂解量最高達(dá)到150 PFU/cell，但潛伏期較長(zhǎng)為40 mi n，VppYZU68、VppYZU81裂解量分別為87、20 PFU/cell，潛伏期分別為20 min和30 min，VppYZU92、VppYZ U110顯示了較短的潛伏期，均為10 min，裂解量分別為35 PFU/cell和58 PFU/cell。

表 33 VVpp噬菌體的裂解特征Table 3 Lysis properties of Vp phaaggeess

2.8 噬菌體BIMF

不敏感突變體的出現(xiàn)，降低了噬菌體裂解宿主菌的能力，通常與細(xì)菌細(xì)胞表面編碼受體分子的基因點(diǎn)突變有關(guān)[19]，多糖等的產(chǎn)生遮蔽了受體，從而抑制噬菌體吸附。測(cè)定5 株噬菌體及其混合物的BIMF，結(jié)果如表4所示。單一噬菌體的BIMF差異性較大；VppYZU81比VppYZU64的BIMF高100 倍，這種差異可能是由于噬菌體的吸附受體不同[20-21]。VppMIX的BIMF值最小，為3.50×10－6，顯著低于單一噬菌體。結(jié)果表明噬菌體混合物可以克服噬菌體抗性突變體的生長(zhǎng)缺陷。

表4 不同噬菌體BIMFTable 4 Frequencies of Vp spontaneous phage resistant mutants

2.9 VppMIX對(duì)海魚(yú)中致病性Vp的抑制作用

應(yīng)用Vp模擬污染的黃魚(yú)作為模型評(píng)價(jià)VppMIX對(duì)Vp的抑制效果，結(jié)果如圖6所示。Vp菌懸液污染的魚(yú)片25 ℃保存5 h，菌落數(shù)由起始的4.13（lg（CFU/g））上升到5.60（lg（CFU/g）），而VppMIX處理的魚(yú)片中Vp總數(shù)下降至2.0（lg（CFU/g））（MOI=1，實(shí)驗(yàn)組3）、1.35（lg（CFU/g））（MOI=100，實(shí)驗(yàn)組2）以及0.93（lg（CFU/g））（MOI=10 000，實(shí)驗(yàn)組1）；在25 ℃貯藏12 h，噬菌體處理組的Vp總數(shù)分別達(dá)到7.51（lg（CFU/g））（MOI=1，實(shí)驗(yàn)組3）、5.40（lg（CFU/g））（MOI=100，實(shí)驗(yàn)組2）以及3.94（lg（CFU/g））（MOI=10 000，實(shí)驗(yàn)組1），均顯著小于對(duì)照組8.92（lg（CFU/g））（P＜0.01）。結(jié)果表明高濃度噬菌體混合物VppMIX可以有效抑制魚(yú)片中多個(gè)致病性Vp株的生長(zhǎng)，高濃度處理更有利于Vp的失活。

圖6 混合噬菌體VppMIX在模擬污染魚(yú)塊中的抑菌效果Fig. 6 Inactivation of Vp in arti ficially contaminated fish fillet by phage cocktail VppMIX

3

討 論

噬菌體在食品及公共環(huán)境領(lǐng)域控制病原菌污染及危害具有良好的應(yīng)用前景[22]。分離篩選廣譜高效的噬菌體分離株對(duì)構(gòu)建高效的生物減菌劑具有重要價(jià)值。本研究從污水樣品中篩選致病性Vp的烈性噬菌體，獲得了5 株噬菌體具有較寬的抑菌譜及良好的耐熱能力，以及較廣的pH值生存范圍，為進(jìn)一步研發(fā)食品加工溫度和酸堿度下噬菌體減菌劑提供了分離株。

噬菌體大量存在于含有其宿主菌的環(huán)境中，目前分離到的Vp噬菌體形態(tài)主要屬于肌尾噬菌體科[23]、長(zhǎng)尾噬菌體科[24]、短尾噬菌體科[25]。本研究發(fā)現(xiàn)5 株噬菌體分離株分別屬于這3 個(gè)科，且針對(duì)同一個(gè)Vp宿主菌株的噬菌體存在不同形態(tài)，同一噬菌體可以對(duì)不同毒力基因型和來(lái)源的Vp產(chǎn)生裂解活性。查濤等[26]研究發(fā)現(xiàn)噬菌體對(duì)不同血清型宿主菌表現(xiàn)出不同的裂解特征，產(chǎn)生不同形態(tài)的噬菌斑，但本研究中并未發(fā)現(xiàn)裂解特征與菌株基因型具有明顯相關(guān)性。結(jié)果表明自然界Vp噬菌體存在高度多樣性，其裂解性與宿主菌來(lái)源無(wú)關(guān)[27]。

不敏感突變體的出現(xiàn)直接影響噬菌體的抑菌效果，不同噬菌體單株產(chǎn)生抗性突變頻率（BIMF）變化很大，而噬菌體混合物的應(yīng)用可以有效降低BIMF[28]，擴(kuò)大裂解宿主范圍。O’Flynn等[20]研究表明較低的BIMF（10－6）并不影響將噬菌體用作生物控制劑，這與本研究的結(jié)果一致。本研究構(gòu)建的5 株Vp烈性噬菌體混合制劑VppMIX，不敏感突變株的產(chǎn)生頻率降低到10－6以下，對(duì)42 株Vp菌株均具有裂解作用，拓寬了抑菌譜。Alagappan等[29]得到了相似的結(jié)論，與單獨(dú)使用相比，3 株Vp噬菌體混合物明顯降低了蝦的死亡率。本研究魚(yú)肉抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VppMIX可以在25 ℃貯藏溫度下有效抑制魚(yú)肉基質(zhì)中Vp增殖，并且生物抑菌效果呈劑量依賴性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，較高的噬菌體濃度通常會(huì)導(dǎo)致更多的細(xì)菌失活[30-31]。