藥用白及資源再生策略初探

張朝陽，符雨薇, 2， 譚耀武，陳永霞，盧 艷，毛心瑩，韓靜茹, 5，萬 娜，6，何俊梅, 2，羅玉琴, 2

(1.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550002；2.貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550025；3.福建中醫(yī)藥大學,福建 福州 350000；4.武陵源人民醫(yī)院, 湖南 張家界 427400；5.貴州中醫(yī)學院，貴州 貴陽550025；6.黔南民族師范學院，貴州 都勻 558000)

白及[Bletillastriata(Thunb.) H. G. Reichenbach] 為蘭科白及屬植物，主產(chǎn)于貴州、四川、湖南、江西等省區(qū)[1]。干燥塊莖是著名中藥，用藥歷史久遠。主要成分包括白及多糖、聯(lián)芐類、菲類及其衍生物；此外，含少量揮發(fā)油、黏液質(zhì)等[2-5]。性味苦、澀、甘，微寒，入歸肺、肝、胃經(jīng)；能收斂止血、消腫生肌，主治內(nèi)外傷出血、癰腫瘡瘍、皮膚皸裂、水火燙傷等[6]。作為傳統(tǒng)中藥復方組成成分以外，白及是白及顆粒、復方白及膏、白及沖劑等多種中成藥的重要原料藥[7]。同時，白及在醫(yī)療、保健、美容領域的用途還在不斷拓展。譬如，以白及制成的白及牙膏，可用于防治口腔潰瘍、咽喉腫痛、牙周炎、牙齦炎、防齲、 口腔異味等口腔和牙科疾病[7-8]；以白及膠制成的白及纖維，可用于功能輔料、生物醫(yī)用增強紡織品、縫合線和穴位埋置線等產(chǎn)品，具有較大的應用潛力[9]。此外，基于白及膠的粘合性能，白及還可用于高級卷煙煙條粘合劑、字畫粘合劑等[6]。因此，白及具有較高的藥用價值和經(jīng)濟價值。近年來，白及種植規(guī)模不斷擴大。為了更好地推動白及資源研究和可持續(xù)利用，本文就白及種質(zhì)及快繁技術研究進展作一綜述，并就白及資源再生策略進行初步探討，為相關研究和生產(chǎn)提供參考。

1 白及資源供需狀況

白及功效多樣，在醫(yī)療、保健、美容及其它工業(yè)領域的用途不斷拓展，資源供求矛盾較為突出,價格逐級攀升(圖1)[7]。長期以來，白及用藥主要利用野生資源，資源利用強度增加導致白及資源逐步匱乏，資源匱乏制約相關產(chǎn)業(yè)發(fā)展并危害遺傳資源安全，國家野生動植物保護已將白及列為Ⅱ級保護植物。對白及野生資源的直接利用不僅違反國家的植物保護法規(guī)而且無法標準化，從而制約相關產(chǎn)品的品質(zhì)提升。白及人工規(guī)模化種植有望改變這一局面。

圖1 2000年至2010年白及價格走勢圖[7]

2 白及種質(zhì)資源研究進展

種質(zhì)種苗是規(guī)?；N植的源頭關鍵環(huán)節(jié)。對于中藥材而言， 從野生種群中篩選優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)自然種源是關鍵。龔曄等[10]基于白及地理分布信息和影響白及分布的主導氣象因子，利用最大熵模型和地理信息系統(tǒng)預測了中國白及的潛在分布與其氣候特征。結(jié)果表明：中國白及潛在分布區(qū)主要位于秦嶺、淮河以南大部分地區(qū)，主要適生省份為云南、湖北、四川、湖南、江西、浙江。表明白及物種分布廣，適應能力強。張萃蓉等[11]對不同產(chǎn)地白及進行了栽培比較試驗，發(fā)現(xiàn)峨眉白及質(zhì)優(yōu)產(chǎn)高，明顯優(yōu)于參試的其他白及。徐中志等[12]對不同地理來源的28份白及種源進行了物候期、形態(tài)特征的分析與評價，結(jié)果表明：不同種源白及的生長物候期、形態(tài)特征以及經(jīng)濟性狀因地理來源不同而存在一定的差異；出苗期變異范圍為5月初-7月初；生育期變異范圍為145～180d，地理種源之間差異明顯；海拔越高，出苗時對溫度的要求越低，在同一地點栽培時出苗時間越早，倒苗時間也相應提前；白及的葉面積與株高呈正相關，即株高越高，葉子越長，葉面積越大；從單株平均重量、抗病性等方面衡量，云南永勝種源較好。黃良永等[13]以HPLC法測定了不同產(chǎn)地白及藥材中1，4- 二[4-(葡萄糖氧)芐基] -2- 異丁基蘋果酸酯的含量，發(fā)現(xiàn)貴州正安白及(3.32%)是云南曲靖白及(1.45%)含量的2倍， 湖北竹溪種源 (含量4.8%～4.9%)是湖北鄖縣白及(含量1.1%)的4～5倍，表明該成分含量與地理分布具有明顯的相關性。和志嬌等[14]利用ISSR分子標記對25份白及種質(zhì)進行了遺傳多樣性的研究，發(fā)現(xiàn)白及屬植物ISSR分子標記位點多態(tài)性比率達到87.90%；25份參試白及種質(zhì)遺傳距離處于0.4483-0.7903之間，種內(nèi)種間具有豐富的遺傳變異。吳明開等[15]針對白及進行了SSR位點引物開發(fā)，獲得了9對能穩(wěn)定擴增的SSR位點引物。對微衛(wèi)星標記的研究[16-17]表明：白及微衛(wèi)星位點等位基因數(shù)變異范圍為3-16，而雜合度變異范圍較為離散。孫宇龍等[18]基于SRAP標記的白及遺傳多樣性研究表明：白及具有較高的遺傳多樣性水平, SRAP標記平均多態(tài)位點百分比(PPB)為90.48%,香農(nóng)信息指數(shù)(I)為0.5096；白及居群間存在中等水平的遺傳分化,遺傳分化指數(shù)Gst為0.2609，遺傳距離和地理距離間有顯著正相關性(r=0.6329;P<0.000 1)。吳勁松等[19]研究了nrDNA ITS、LFY 同源基因內(nèi)含子2、葉綠體ycf1 基因在白及屬植物中的變異，發(fā)現(xiàn)白及屬物種nrDNA ITS 和ycf1 序列的種間變異(0.022～0.106 和0.017～0.106) 明顯大于種內(nèi)變異(0～0.012 和0～0.015)； 基于nrDNA ITS 和ycf1 序列的NJ 樹能準確地區(qū)分白及屬4 個物種。 另外，Mi等[20]基于等位酶多樣性數(shù)據(jù)認為白及經(jīng)歷了末次盛冰期向南遷徙，然后從冰期避難所回復擴散的過程。這些研究表明白及物種分布廣泛，具有復雜的擴散分化歷史，其種質(zhì)資源因環(huán)境異質(zhì)性而呈現(xiàn)多樣化，具有豐富的產(chǎn)量、品質(zhì)相關遺傳變異，具有較大的選育種潛力。

從育種進程上看，張萃蓉等[11]發(fā)現(xiàn)了質(zhì)優(yōu)產(chǎn)高的峨眉白及；徐中志等[12]獲得了數(shù)個適應云南當?shù)丨h(huán)境條件的優(yōu)良種源；吳明開等[15]從梵凈山居群篩選出了優(yōu)良單株；安徽振揚農(nóng)林有限公司培育并命名了一個栽培品系-‘巨莖白及’，該品系產(chǎn)量較高，分類上被歸于白及[19]。這些品種的發(fā)現(xiàn)為白及人工種植提供了基礎的種源選擇。白及遺傳資源分布廣，變異豐富。同時，其同屬近緣種黃花白及B.ochraceaSchlechter、小白及B.formosana(Hayata) Schlechter、華白及B.sinensis(Rolfe) Schlechter在我國也有分布，這些近緣種在化學成分和生物學特性上與白及有相似亦有差異，它們相互間能否進行資源替代？是否具有某些方面的獨特優(yōu)勢？這些問題的進一步揭示，將拓展藥用白及的品種資源。有理由相信隨著評價取材范圍的進一步拓展，會有更多更好的自然種源出現(xiàn)。

3 白及繁育技術研究進展

白及為多年生草本，雖然能開花結(jié)果，但種子無胚乳，在自然狀態(tài)下，極少萌發(fā)成苗。傳統(tǒng)上，藥農(nóng)主要依靠塊莖繁殖，效率低，成本高。建立并完善白及快繁技術體系，規(guī)?；?、低成本生產(chǎn)白及種苗，具有較大的現(xiàn)實意義和價值。

以種子為外植體進行白及微繁是相對簡易的一種方式。曾宋君等[21]研究了白及的無菌播種及試管苗莖尖組織培養(yǎng)實驗。結(jié)果表明:種子在基本成熟時胚的萌發(fā)率和成苗率最高,萌發(fā)期與成苗期最短;胚萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為1/2MS;在培養(yǎng)基中加入10 %的椰子汁能提高萌發(fā)率與成苗率,加入1%的活性炭有利于試管苗的生長;試管苗莖尖在MS培養(yǎng)基附加6-BA 0.5mg/L和NAA 0.2mg/L時增殖效果好;生根培養(yǎng)以1/2MS培養(yǎng)基附加NAA 0.5mg/L效果最好,加上10%的香蕉汁有利于生根壯苗。張燕等[22-23]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基附加低濃度的6-BA、KT將抑制種子的萌發(fā)和生長，附加活性炭和GA3有利于根系生長發(fā)育和植株長勢，腐殖土和蛭石1∶1混合作為煉苗基質(zhì)，煉苗成活率可達90%以上；對白及種子原球莖發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)1/2MS、6-BA 5.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L對原球莖誘導具有較好效果。吳明開等[15]以種子無菌萌發(fā)為基礎建立了白及種苗規(guī)?；a(chǎn)技術體系，發(fā)現(xiàn)1/2MS添加NAA 0.5 mg/L可作為種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基；1/2MS添加NAA 0.2-0.5 mg/L、白糖2%、瓊脂0.7%、活性炭0.1%為較佳的生根培養(yǎng)基；鄒娜等[24]發(fā)現(xiàn)MS、KT1.0 mg/L、NAA0.5 mg/L對于以種子為材料誘導原球莖和芽的分化效果較好；培養(yǎng)基MS、6-BA 0.45 mg/L、NAA 0.4 mg/L對于壯苗生根培養(yǎng)有利。張潔等[25]以白及成熟蒴果為材料，以1/2 MS加5%土豆汁、5%白砂糖為發(fā)芽培養(yǎng)基，以1/2 MS添加6-BA 2 mg/L、NAA 0．5 mg/L、5%土豆汁、5%白砂糖為增殖壯苗培養(yǎng)基進行種苗擴繁，然后用蔬菜育苗基質(zhì)和漂盤進行馴化栽培，獲得較好效果，成活率高達95%以上，整個育苗周期為160d左右。張宇思等[26]研究了白及種子萌發(fā)和原球莖生長的液相-固相培養(yǎng)基培養(yǎng)效果,比較了全程固體培養(yǎng)基培養(yǎng)(QG)與液體固體培養(yǎng)基分段培養(yǎng)(YG)這2種培養(yǎng)方式的優(yōu)劣。結(jié)果表明：添加劑種類、大量元素、6-BA濃度、NAA濃度對白及種子萌發(fā)及原球莖誘導影響最大，最佳培養(yǎng)條件為1/4MS添加1mg/L NAA、0.5 mg/L 6-BA、100 g/L馬鈴薯汁、30g/L蔗糖,pH值5.8,培養(yǎng)溫度22 ℃,搖床轉(zhuǎn)數(shù)100r/min,每天光照時間8 h；源于YG的白及苗在移栽成活率、葉片顏色、葉片長度、苗高幾個方面均優(yōu)于源于QG的白及苗,且差異顯著。 此外，李偉平等[27]以白及種子為材料，在1/2MS培養(yǎng)液中萌發(fā)后作為包埋材料，建立了白及人工種子制作方法，為白及繁育提供了一條新途徑；李晶等[28]研究了成熟黃花白及種子非共生萌發(fā)及幼苗發(fā)育條件，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯、蔗糖、NAA、6-BA 4個因素對種子萌發(fā)率的影響不顯著，但蔗糖和馬鈴薯對幼苗發(fā)育的影響顯著，培養(yǎng)基含蔗糖10g/L、 馬鈴薯100g/L、6-BA0.5g/L時幼苗發(fā)育較好，可為白及種子微繁技術優(yōu)化提供參考。

以白及根、莖尖為外植體進行叢生芽誘導增殖也獲得了一定程度的探索。余朝秀等[29]發(fā)現(xiàn)MS添加6-BA 1.0-3.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L可誘導白及莖尖及側(cè)芽萌生增殖芽;MS添加KT 4.0mg/L、NAA 0.2mg/L誘導增殖的效果最好,培養(yǎng)40d后增殖率可達450%;1/2 MS添加NAA 0.5mg/L有利于生根,且植株長勢健壯； 以60%腐葉土、30%珍珠巖、10%素紅土混合作為煉苗基質(zhì)可獲得較好煉苗效果;煉苗溫度23-27℃,空氣相對濕度80%-90%有利于提高煉苗成活率。雷湘等[30]發(fā)現(xiàn)1/2MS添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 2.0 mg/L能很容易地從幼根誘導出叢生芽；MS添加6-BA 1.0 mg/L、NAA0.05 mg/L利于叢生芽增殖；1/2MS添加NAA 0.5 mg/L利于生根培養(yǎng)。

通過外植體-愈傷誘導-類原球莖形成再到植株再生是白及微繁技術體系的重要途徑。針對白及愈傷和原球莖誘導增殖的研究[31]表明: 原球莖或莖尖在添加2,4-D 或NAA的Vacin and Went (VW) 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3-5周后即可形成綠色愈傷；以原球莖作為外植體，培養(yǎng)基添加2,4-D 1.0mg/L，可獲得48.0%的誘導成功率；NAA和2,4-D可顯著促進愈傷增殖，2,4-D 1.0mg/L和TDZ 1.0mg/L的激素組合可獲得最快愈傷生長，增殖率在3個月內(nèi)達到46.2倍；6-BA可顯著促進愈傷形成類原球莖；培養(yǎng)基添加6-BA 1.0mg/L在3個月內(nèi)可使100 mg愈傷形成48.4個類原球莖；6-BA和TDZ可促進類原球莖的直接形成，以原球莖為外植體，培養(yǎng)基添加6-BA 0.5mg/L可觀察到最高的誘導率和類原球莖形成數(shù); 并且，通過ISSR分子標記檢測，通過生長調(diào)節(jié)劑誘導再生的植株克隆保真度可達99.5%-100%，表明通過微繁流程再生植株在遺傳上是穩(wěn)定的。

總體來看，白及組培快繁技術已獲得了系統(tǒng)性進展，已實現(xiàn)快速規(guī)?；N苗生產(chǎn)。但組培快繁方法途徑多樣，接種環(huán)節(jié)較多，部分研究機構(gòu)已在嘗試大棚種子直播育苗。如何進一步優(yōu)化培養(yǎng)基、簡化工藝流程，提高成活率，降低生產(chǎn)成本，使白及快繁技術日臻完善并對蘭科植物快繁通用關鍵技術做出貢獻是后續(xù)研究中值得考慮的問題。

4 白及資源再生策略初探

如前所述，白及功效多樣，在醫(yī)療、保健、美容及其它工業(yè)領域的用途不斷拓展，資源供求矛盾較為突出。長期以來，白及用藥主要利用野生資源，資源利用強度增加導致白及資源逐步匱乏，資源匱乏制約相關產(chǎn)業(yè)發(fā)展并危害遺傳資源安全，國家野生動植物保護已將白及列為Ⅱ級保護植物。對白及野生資源的直接利用不僅違反國家的植物保護法規(guī)而且無法標準化，從而制約相關產(chǎn)品的品質(zhì)提升。因此，白及人工規(guī)?；N植必不可少。種質(zhì)資源研究是人工規(guī)模化種植的首要環(huán)節(jié)。白及物種分布廣泛，具有復雜的擴散分化歷史，其種質(zhì)資源因環(huán)境異質(zhì)性而呈現(xiàn)多樣化，具有豐富的產(chǎn)量、品質(zhì)相關遺傳變異，具有較大的選育種潛力。加強白及種質(zhì)資源研究的深度和廣度，從生物量、關鍵化學成分、適生范圍等方面進行較為精細的居群比較研究，從野生種質(zhì)資源中篩選出高產(chǎn)高含量、適生性好的優(yōu)質(zhì)種源或?qū)Ｓ梅N質(zhì)還大有可為。白及繁殖可依靠塊莖增殖、種子或組織培養(yǎng)來進行繁殖。鑒于白及種子數(shù)量巨大，白及種子培養(yǎng)及組織培養(yǎng)技術亦已獲得系統(tǒng)性進展，利用數(shù)量龐大的白及種子通過種子培養(yǎng)來進行白及種苗快繁是現(xiàn)階段白及繁育的最優(yōu)選擇。

白及人工種植較為星散，種植區(qū)域分布在滇、黔、川、渝、湘、贛、桂、皖等省。鑒于不同白及種源在生態(tài)適應性、化學成分及藥用功效方面具有一定的差異，這一種植格局有利于維持白及種質(zhì)資源的多樣性以及藥用功效的特型化。因此，從宏觀策略上應鼓勵多區(qū)域、多種源種植。病蟲害防治是白及種植成功較為關鍵的問題。成片連塊大規(guī)模種植易于發(fā)生病蟲害。利用中國西南山地高原地區(qū)的地形地貌特點發(fā)展山地小塊種植，對于降低白及種植病蟲害防治成本具有很大的優(yōu)勢。白及生產(chǎn)周期較長，從種苗到收獲平均需要3-4年。這一生產(chǎn)特點對于急需收獲的種植者來說是較大的弊端。但白及為耐陰植物，可用于林下間作。西南山地高原地區(qū)具有大量的桃、李、梨、蘋果、柑橘、油茶等林木。這些林木往往是單一種植，受市場波動影響較大。將白及用于這些林木種植的林下間作，將在節(jié)約耕地以及減緩市場波動影響方面發(fā)揮重要作用。另外，林下間作也有利于白及的病蟲害防治和綜合管護，降低生產(chǎn)成本。因此，種子繁殖、山地小塊種植、林下間作將可能成為高效率、低成本、可持續(xù)進行白及資源再生的常規(guī)措施。

致謝:

感謝楊小生博士、 潘衛(wèi)東博士對本文給出寶貴意見。