寧腎祛濕化瘀湯對(duì)狼瘡腎炎小鼠AT1R、HIF-1α和HO-1 mRNA的影響*

黃 上，朱克儉，涂 岑，郭玉星

（湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是由多種自身抗體產(chǎn)生全身多系統(tǒng)損害的自身免疫性疾病，它的主要特征為以血清中出現(xiàn)抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）為代表的多種自身抗體和多器官、多系統(tǒng)受累。SLE累及腎臟引起的腎損害被稱為狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）。SLE最常見且嚴(yán)重的內(nèi)臟損害就是LN。從臨床表現(xiàn)來看，70%以上的SLE患者腎臟受累，從腎組織病理活檢情況來看，幾乎所有SLE患者均有腎臟損害[1]，SLE預(yù)后受腎臟病變的嚴(yán)重程度的直接影響[2]。LN臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣、程度不同表現(xiàn)不同，但主要表現(xiàn)為蛋白尿、血尿、管型尿，或伴有高血壓、水腫等臨床腎損害和腎功能減退的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其臨床診治困難，易使病情逐漸進(jìn)展，部分患者最終進(jìn)展為終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）[3]。LN 的病因和發(fā)病機(jī)制目前還不明朗，治療效果亦是良莠不濟(jì)。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒藥物、生物制劑、干細(xì)胞移植、大劑量免疫球蛋白沖擊療法等治療，取得了一定效果。但這些藥物的復(fù)發(fā)率高、副作用大、價(jià)格昂貴等劣勢限制了其長期使用，而且因?yàn)镾LE的復(fù)雜性、異質(zhì)性，若單純干預(yù)某一環(huán)節(jié)的治療往往難以起到理想效果。中醫(yī)藥是我國醫(yī)學(xué)資源中的瑰寶，長期臨床實(shí)踐證實(shí)中醫(yī)藥具有多部位、多環(huán)節(jié)和多靶點(diǎn)的整體調(diào)節(jié)功能，同時(shí)在療效的提高、預(yù)后的改善、復(fù)發(fā)的減少、病情長期穩(wěn)定的維持、激素減量使用等方面有著較佳表現(xiàn)。對(duì)于具有基因調(diào)控、發(fā)病機(jī)理復(fù)雜、病情多變的LN患者，采用中醫(yī)藥治療具有非常重要的意義。在臨床上我科常采用寧腎祛濕化瘀湯治療該病并取得了較好的效果。但該病致病機(jī)制如何，該復(fù)方如何起到治療效果，其作用靶點(diǎn)在哪，均值得進(jìn)一步研究證實(shí)。通過文獻(xiàn)學(xué)習(xí)發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ 1型受體（AT1R）、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）和血紅素氧合酶-1（HO-1）在LN中具有重要作用[4-5]。因此，本實(shí)驗(yàn)建立狼瘡腎炎小鼠模型，探討寧腎祛濕化瘀湯治療LN的作用機(jī)制，觀察寧腎祛濕化瘀湯對(duì)狼瘡腎炎小鼠腎組織AT1R、HIF-1α及HO-1 mRNA表達(dá)的影響，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡清潔級(jí)雄性DBA/2J小鼠、B6D2F1小鼠，體質(zhì)量20～22 g（由湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004，SCXK（湘）2016-0012。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 寧腎祛濕化瘀湯：熟地15 g，麥冬10 g，干生地10 g，桃仁10 g，柴胡6 g，紅花10 g，當(dāng)歸15 g，牛膝10 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g，黃芪20 g，白蔻仁10 g，木香10 g，甘草6 g。由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科提供，加水煎煮2次后，制備寧腎祛濕化瘀湯水煎液，生藥濃度為7.8 g/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 IgG-ELISA試劑盒（Abcam，ab151276）、IgG1-ELISA 試劑盒（Abcam，ab133045）、IgG2a-ELISA 試劑盒（Abcam，ab133046），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，CW2582）、熒光定量PCR試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，CW3008）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)小鼠體質(zhì)量，隨機(jī)分為空白組、生理鹽水組、寧腎祛濕化瘀湯低、中、高劑量組，每組10只。

1.4.2 動(dòng)物造模 采用慢性移植物抗宿主病（cGVHD）的方法誘導(dǎo)狼瘡腎炎小鼠模型[6]：首先采用頸椎脫位法將DBA/2J雄性小鼠（供體小鼠）處死，用75%乙醇浸泡消毒5 min后，在無菌原則下取出小鼠淋巴結(jié)、胸腺、脾，放入器皿中，剪碎、研磨、過濾。Tris-NH4Cl紅細(xì)胞裂解液裂解懸浮細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞懸液至所需濃度。將已調(diào)節(jié)好濃度的DBA/2J鼠細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸入B6D2F1小鼠（同周齡）。按每鼠輸入1×108個(gè)/mL，每周2次免疫小鼠，共4次。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)干預(yù) 在造模2周后，各組予相應(yīng)實(shí)驗(yàn)藥物灌胃，具體劑量參照根據(jù)徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值表計(jì)算出每只寧腎祛濕化瘀湯低劑量組小鼠每日灌服寧腎祛濕化瘀湯19.5 g/kg，根據(jù)低、中、高劑量用藥量比例為1∶2∶4得出中、高劑量組的給藥劑量分別為每日39、78 g/kg；空白組、生理鹽水組小鼠予生理鹽水灌胃，25 mL/kg，1次/d，共干預(yù)8周。

1.5 觀察指標(biāo) 從造模后開始，每周收集一次24 h小鼠尿液，使用尿蛋白定性測試盒（磺基水楊酸法）（南京建成生物，C035-1-1）定性實(shí)驗(yàn)：取新鮮尿液轉(zhuǎn)移入小試管。滴加磺基水楊酸溶液3～4滴，形成界面。立即觀察，如有渾濁，提示尿液中含有蛋白質(zhì)，渾濁深淺表示含量多少；確定尿蛋白含量以得出尿蛋白發(fā)生率。干預(yù)建模8周后，采血ELISA測定空白組和模型組小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a，處死小鼠，取空白組及模型組小鼠肝、腎、腸，觀察病理情況，ELISA數(shù)據(jù)和HE染色的數(shù)據(jù)均只檢測空白組和模型組并進(jìn)行比對(duì)。

1.6 qPCR檢測 為證明建模成功，取各組腎組織采用qPCR檢測AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA表達(dá)。qPCR引物序列（Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)）GAPDH-F：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，GAPDH-R：5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'；AT1R-F：5'-ATGCTTGGGGCAACTTCACTA-3'，AT1R-R：5'-CGGTGCATGTGGTAGACGAG-3'；HIF-1α-F：5'-TCTCGGCGAAGCAAAGAGTC-3'，HIF-1α-R：5'-AGCCATCTAGGGCTTTCAGATAA-3'；HO-1-F：5'-AGGTACACATCCAAGCCGAGA-3'，HO-1-R：5'-CATCACCAGCTTAAAGCCTTCT-3'。

組織樣品提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成的cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于實(shí)時(shí)定量PCR，目的基因?yàn)锳T1R、HIF-1α、HO-1，以 GAPDH 作為內(nèi)參。qPCR 參數(shù)為：95℃預(yù)變性60 s 1個(gè)循環(huán)，95℃變性15 s和57℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。mRNA濃度通過公式x=2-△△Ct計(jì)算，其中x=各組目的基因經(jīng)GAPDH校正后相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠蛋白尿發(fā)生率 從造模后第1周開始至第8周，空白組小鼠蛋白尿發(fā)生率為0%，模型組每周逐量遞增，至第8周發(fā)生率為100%，而寧腎祛濕化瘀湯中高劑量組蛋白發(fā)生率較模型組明顯降低，且寧腎祛濕化瘀湯3組劑量越高發(fā)生率越低，存在劑量趨勢，見表1。

表1 各組小鼠蛋白尿發(fā)生率（±s，n=10，%）

表1 各組小鼠蛋白尿發(fā)生率（±s，n=10，%）

組別 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周空白組 0 0 0 0 0 0 0 0模型組 10 20 40 40 50 70 80 100寧腎祛濕化瘀湯低劑量組 10 20 30 40 50 60 70 80寧腎祛濕化瘀湯中劑量組 10 10 20 20 30 30 50 60寧腎祛濕化瘀湯高劑量組 10 10 10 20 20 20 30 40

2.2 空白組、模型組血清造模8周后IgG、IgG1、IgG2a變化 模型組小鼠在造模8周后血清中總的IgG、IgG1、IgG2a含量明顯高于空白組（P<0.05），說明cGVHD法造模后IgG、IgG1、IgG2a明顯升高，符合該法造模成功表現(xiàn)，見表2。

2.3 病理學(xué)結(jié)果 空白組小鼠肝腎腸病理檢查未見明顯異常。模型組可見肝細(xì)胞局灶性壞死、萎縮、肝索排列紊亂，在匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤嚴(yán)重；腎臟見高度增生的腎小球毛細(xì)血管壁，其襻內(nèi)的細(xì)胞數(shù)明顯增多，有大量的炎性細(xì)胞浸潤腎間質(zhì)，有大量蛋白管型見于晚期腎小管腔內(nèi)；腸黏膜下層見大量的淋巴細(xì)胞浸潤，上皮黏膜呈現(xiàn)壞死表現(xiàn)。見圖1。

表2 空白組、模型組IgG、IgG1、IgG2a變化（±s，n=10，ng/mL）

表2 空白組、模型組IgG、IgG1、IgG2a變化（±s，n=10，ng/mL）

注：與空白組比較，aP＜0.05

組別 IgG IgG1 IgG2a空白組 775±147.1 578±183.5 240±47.4模型組 1431±230.7a 1516±355.4a 464±89.2a

2.4 AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA變化 與空白組比較，模型組 AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA 表達(dá)升高（P<0.05），說明小鼠造模后腎組織中AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA表達(dá)增高。與模型組比較，寧腎祛濕化瘀湯低、中、高劑量組 AT1R、HIF-1α、HO-1 的 mRNA表達(dá)降低（P<0.05）。而且寧腎祛濕化瘀湯低、中、高劑量組中腎組織AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA水平的降低存在劑量趨勢，高劑量組降低最明顯，見表3。

表3 各組 AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA 表達(dá)水平（±s，n=10）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與寧腎祛瘀化濕湯低劑量組比較，cP＜0.05

HIF-1α 1±0模型組 -HO-1空白組 - 1±0組別劑量/（g·Kg-1）AT1R 1±0 3.71±0.78a 3.76±0.30a 2.93±0.53a寧腎祛濕化瘀湯低劑量組 19.5 2.48±0.10b 3.24±0.35b 2.10±0.28b寧腎祛濕化瘀湯中劑量組 39 1.48±0.11bc 1.80±0.26bc 1.82±0.24bc寧腎祛濕化瘀湯高劑量組 78 1.24±0.16bc 1.13±0.06bc 1.04±0.07bc

3 討論

LN發(fā)病率逐年遞增[7]，嚴(yán)重影響人民生活質(zhì)量，雖引起了大家的重視，但是其病因和發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚。在治療上，目前臨床主要以糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒藥物、生物制劑、干細(xì)胞移植、大劑量免疫球蛋白沖擊療法等治療，雖取得了一定效果，但是它們的副作用不容忽視[8]。中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)，副作用小的特點(diǎn)，用于治療該病取得了良好效果[9-15]。寧腎祛濕化瘀湯為我院治療狼瘡腎炎的經(jīng)驗(yàn)方，已在臨床運(yùn)用10余年，該方主要由熟地、麥冬、干生地、桃仁、柴胡、紅花、當(dāng)歸、牛膝、茯苓、白術(shù)、黃芪、白蔻仁、木香等藥物組成，共奏滋陰祛濕化瘀之功效。補(bǔ)益腎陰，扶助正氣，有利于濕熱、瘀血的清散；利濕有利于腎陰的恢復(fù)；祛瘀使水利氣行，滋腎利濕祛瘀三者相得益彰，在臨床治療中取得較好的效果，但其作用機(jī)制不明?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA[16-19]在 LN中具有重要作用。血管緊張素受體（Angiotensin receptor，ATR）有4種：AT1R，AT2R，AT3R，AT4R。在腎臟主要通過AT1R和AT2R發(fā)揮生物學(xué)作用，AT1R有調(diào)節(jié)血壓、腎血流量、腎小球?yàn)V過率、水和電解質(zhì)代謝以及刺激組織細(xì)胞增生等功能。缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducibler，HIF）是在缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體細(xì)胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1的表達(dá)以腎、心、胸腺最高，肝、脾、肺、睪丸次之，骨骼肌最低。α亞基為HIF-1所特有，HIF-1的生理活性主要取決于HIF-1α亞基的活性和表達(dá)，HIF-1α僅在缺氧細(xì)胞核中存在。研究證實(shí)[16]T1R，HIF-1 α表達(dá)增加在LN的發(fā)病和疾病的發(fā)展中有重要作用，參與LN細(xì)胞增殖、炎性浸潤、缺血缺氧以及腎臟損傷進(jìn)入纖維化的階段。HIF-1α表達(dá)上調(diào)是機(jī)體缺氧早期首先發(fā)生的分子水平的適應(yīng)性反應(yīng)，并可促進(jìn)多個(gè)靶基因表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)與缺氧有關(guān)的各種病理生理反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生一系列缺氧適應(yīng)反應(yīng)。HIF-1α下調(diào)血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）可能是其主要途徑之一[20]。因此研究它們之間的關(guān)系對(duì)于厘清發(fā)病機(jī)制、作用靶點(diǎn)及中醫(yī)藥推廣具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，從造模后至第8周后空白組小鼠蛋白尿發(fā)生率為0，模型組每周逐量遞增，至第8周發(fā)生率為100%，說明用cGVHD法造模后蛋白尿明顯增高。模型組小鼠在造模8周后血清中總的IgG、IgG1、IgG2a含量明顯高于空白組（P<0.05），說明cGVHD法造模后IgG、IgG1、IgG2a明顯升高；模型組小鼠肝腎腸表現(xiàn)出狼瘡腎炎的病理結(jié)果。綜合以上結(jié)果說明采用慢性移植物抗宿主?。╟GVHD）的方法誘導(dǎo)狼瘡腎炎小鼠模型復(fù)制成功[6]。

模型組小鼠蛋白尿發(fā)生率明顯增高，而寧腎祛濕化瘀湯各組明顯降低，且存在劑量趨勢，說明寧腎祛濕化瘀湯可改善狼瘡腎炎癥狀，且高劑量效果最佳。從腎組織AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA變化來看，模型組中三者較空白組明顯升高，說明三者在LN發(fā)生過程中具有重要作用，而用寧腎祛濕化瘀湯3組劑量均較模型組明顯降低，且AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)出劑量趨勢，高劑量最強(qiáng)，同時(shí)減輕了腎炎癥狀（3組均明顯降低了尿蛋白發(fā)生率），說明AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA表達(dá)與LN發(fā)展呈現(xiàn)出正相關(guān)趨勢，而寧腎祛濕化瘀湯具有明顯抑制AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA表達(dá)的作用，由此推斷寧腎祛濕化瘀湯治療LN可能是通過抑制AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA表達(dá)而起作用的。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出，寧腎祛濕化瘀湯可改善狼瘡腎炎小鼠模型癥狀，其作用機(jī)制可能與降低腎臟中AT1R、HIF-1α、HO-1 mRNA表達(dá)有關(guān)。但是由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)存在不確定性因素較多，證實(shí)它們的關(guān)系還需結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究還存在一定的局限性，本實(shí)驗(yàn)僅僅采用3個(gè)劑量比較而未加入陽性對(duì)照藥物，會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所偏倚，實(shí)驗(yàn)中只是選取了基因表達(dá)檢測而未行免疫組織化學(xué)或蛋白質(zhì)免疫印跡測定三者蛋白表達(dá)，證據(jù)支持力略顯偏弱，這些有待于后續(xù)進(jìn)一步研究改進(jìn)。