3種蓑蘚屬(Macromitrium)植物DNA C-值測(cè)定

解夢(mèng) 印麗萍 婁玉霞 郭水良

摘 要： 分別以小立碗蘚（Physcomitrella patens）和水稻（日本晴亞種）（Oryza sativa spp.japonica）為標(biāo)樣，用流式細(xì)胞術(shù)分別測(cè)定了中華蓑蘚（Macromirium cavaleriei）、鈍葉蓑蘚（M.japonicum）和缺齒蓑蘚（M.gymnostomum）3種蘚類植物的DNA C-值，由此建立了應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定蓑蘚屬植物DNA C-值的方法，討論了影響蘚類植物DNA C-值測(cè)定結(jié)果的因素.最后討論了苔蘚植物DNA C-值變異式樣、系統(tǒng)發(fā)育和分類學(xué)意義，以及今后有關(guān)蘚類植物DNA C-值研究中值得關(guān)注的幾個(gè)方向.

關(guān)鍵詞： 蓑蘚; 流式細(xì)胞術(shù); DNA C-值; 蘚類植物

中圖分類號(hào)： Q 949.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)： 1000-5137（2019）02-0188-09

0 引 言

DNA C-值指一個(gè)物種配子核中沒有復(fù)制時(shí)的DNA含量（單位：pg）.與DNA C-值密切相關(guān)的概念是基因組的大小，后者指配子中單組染色體的DNA含量[1].

真核生物細(xì)胞核的DNA由編碼DNA和非編碼DNA兩部分組成，后者占核DNA總量的絕大部分，是細(xì)胞染色體構(gòu)架的主體[2-3].真核生物不僅通過(guò)細(xì)胞核中編碼DNA的表達(dá)，也通過(guò)核DNA 本身質(zhì)量及體積的物理作用來(lái)影響表型.因此，物種的核DNA含量有重要的生物和生態(tài)學(xué)意義[4].

被子植物DNA C-值的研究已經(jīng)取得了一系列成果，發(fā)現(xiàn)其在不同種類間存在巨大的差異[5]，并具有進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育上的意義[6].DNA C-值能夠用于雜交種識(shí)別和一些疑難種分類處理[7-8].KRAAIJEVELD [9]發(fā)現(xiàn)DNA C-值與被子植物某些分類群的物種多樣性有關(guān).隨著DNA C-值變大，物種滅絕的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加[10].在被子植物的有些類群中存在 DNA C-值的種下變異，這可能與它們對(duì)生境的適應(yīng)有關(guān)[11].人們已經(jīng)在部分被子植物中發(fā)現(xiàn)DNA C-值與海拔高度、緯度、經(jīng)度、氣溫、雨量之間呈現(xiàn)出相關(guān)性[12-13]，因而具有生態(tài)適應(yīng)意義.目前已測(cè)定了約7542種被子植物的DNA C-值[14]，約占被子植物種數(shù)的3%.

RESKI等[15]運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了小立碗蘚（Physcomitrella patens （Hedw.） B.S.G.）野生型和突變株的核DNA含量，這是最早有關(guān)苔蘚植物DNA C-值的報(bào)道.TEMSCH等[16]用碗豆（Pisum sativum）為內(nèi)標(biāo)，運(yùn)用福爾根染色法測(cè)定了奧地利30種泥炭蘚屬（Sphagnum L.）植物的DNA C-值，發(fā)現(xiàn)其中26種為單倍體，4種為二倍體，單倍體種的DNA 1C-值為0.392～0.506 pg;二倍體種的DNA 1C-值（沒有復(fù)制時(shí)的配子中的DNA含量）為0.814～0.952 pg;并發(fā)現(xiàn)組內(nèi)的DNA 1C-值變異大于組間.RENZAGLIA等[17]應(yīng)用福爾根顯微分光光度計(jì)法測(cè)定了17種苔蘚植物精子的DNA 含量，發(fā)現(xiàn)短角苔（Notothylas orbicularis）和黃角苔（Phaeoceros laevis）的DNA 1C-值最低，分別是0.17 pg和0.26 pg;在苔類中DNA 1C-值從Blasia pusilla的0.49 pg到Pellia epiphylla的4.05 pg，發(fā)現(xiàn)在測(cè)定的苔蘚植物中，DNA C-值大小與染色體數(shù)目沒有相關(guān)性，但是與精子的體積呈正相關(guān).VOGLMAYR[18]測(cè)定了138種蘚類植物的DNA C-值，發(fā)現(xiàn)DNA C-值最小的是苞領(lǐng)蘚屬（Holomitrium）的H.arboreum，DNA C-值為0.17 pg，最大的是小萼苔屬（Mylia Gray）的M.taylorii，為7.97 pg.到目前為止，有7篇論文共報(bào)道了232種苔蘚植物的DNA C-值[19]，約占苔蘚植物種數(shù)的1%.

苔蘚植物中配子體占優(yōu)勢(shì)，又有原絲體、雙鞭毛精子、無(wú)維管束等有別于被子植物的性狀，在生態(tài)分布、繁育和傳播方式、生活型等方面也與被子植物不同.因此，苔蘚植物中DNA C-值的變異式樣，及其生態(tài)適應(yīng)、地理分布、分類學(xué)和進(jìn)化學(xué)上的意義肯定也有別于被子植物，要闡明這些問(wèn)題，需要在更多的苔蘚植物類群中測(cè)定DNA C-值.

本文作者以3種蓑蘚屬植物為對(duì)象，分別應(yīng)用日本晴（Oryza sativa ssp.japonica，DNA 1C-值約為0.4 pg）和小立碗蘚（Physcomitrella patens，DNA 1C-值約為0.5 pg）為外標(biāo)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了它們的DNA C-值，旨在闡明兩種不同測(cè)定方法的結(jié)果差異，建立苔蘚植物DNA C-值測(cè)定的方法.

1 蓑蘚屬3種植物的DNA C-值測(cè)定

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中華蓑蘚（M.cavaleriei Card.& Thér.）、缺齒蓑蘚（M.gymnostomum Sull.& Lesq.）、鈍葉蓑蘚（M.japonicum Dozy & Molk.）是中國(guó)東部地區(qū)常見的3種蓑蘚屬植物，分別采自福建永安天寶巖保護(hù)區(qū)、浙江嵊山福善寺旁公路邊、浙江臺(tái)州九峰公園.憑證標(biāo)本存放于上海師范大學(xué)苔蘚植物標(biāo)本室.

實(shí)驗(yàn)采用兩種標(biāo)樣作對(duì)比，其中小立碗蘚采自云南昆明宜良縣，日本晴由上海市出入境檢驗(yàn)檢疫局提供.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞核分離緩沖液

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定DNA C-值時(shí)主要使用以下幾種核分離緩沖液：

LB01緩沖液：15 mmol·L-1 Tris，2 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA），0.5 mmol·L-1 spermine （精胺）.4HCl，80 mmol·L-1 KCl，20 mmol·L-1NaCl，15 mmol·L-1 β-mercaptoethanol（β-巰基乙醇），0.1% （體積分?jǐn)?shù)） TritonX-100，去離子水定容至200 mL，pH=7.5[20].

Arumuganathan & Earle 緩沖液：9.53 mmol·L-1MgSO4·7H2O，47.67 mmol·L-1 HEPES，6.48 mmol·L-1二硫蘇糖醇（DTT），25 g·mL-1 （質(zhì)量濃度） Triton X-100，去離子水定容至200 mL，pH=8.0[21].

Marie′s nuclear isolation 緩沖液：50 mmol·L-1葡萄糖，15 mmol·L-1 NaCl，5 mmol·L-1 Na2EDTA，50 mmol·L-1檸檬酸鈉，0.5% （體積分?jǐn)?shù)） Tween20，50 mmol·L-1HEPES，0.5%（體積分?jǐn)?shù)）β-巰基乙醇，去離子水定容至200 mL，pH=7.2[22].

Otto 緩沖液：100 mmol·L-1檸檬酸，0.5% （體積分?jǐn)?shù)）Tween20，去離子水定容至200 mL，pH≈2.3[23].

Galbraith 緩沖液：45 mmol·L-1 MgCl2，30 mmol·L-1檸檬酸鈉，20 mmol·L-1 MOPS（4-丙磺酸基嗎啉）和1 g·mL-1 （質(zhì)量濃度） Triton X-100，去離子水定容至 200 mL，pH=7.0[24].

其中 LB01緩沖液、Arumuganathan & Earle 緩沖液和 Marie′s nuclear isolation緩沖液的制備步驟較多，且含有對(duì)人體有害成分，故選用Otto緩沖液和Galbraith緩沖液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹25].

1.2.2 操作步驟

取樣品和標(biāo)樣葉片約50 mg，置于塑料平皿中，分別加入1 mL緩沖液，平皿置于冰上.使用鋒利剃須刀片快速將葉片切碎，用孔徑為30 μm的無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾后，濾液置于容積為2 mL的離心管中，離心（1600 r·min-1，5 min），棄上清.直接加200 μL熒光染料PI-Rnase（基因公司 550825），置于4 ℃避光染色20 min.將制備好的經(jīng)染色的細(xì)胞核懸液轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)上樣管中，上機(jī)測(cè)定[26].同時(shí)準(zhǔn)備一只裝有2～3 mL次氯酸鈉溶液（有效氯體積分?jǐn)?shù)為0.5%）的上樣管，用以消毒.每根上樣管結(jié)束測(cè)試后都需要用消毒液沖洗.每個(gè)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3次重復(fù).

1.2.3 待測(cè)樣品上機(jī)分析測(cè)定

測(cè)定儀器為美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細(xì)胞儀.經(jīng)PI-Rnase染色的樣品通過(guò)流式細(xì)胞儀，從附帶軟件CellQuestTM Pro獲取數(shù)據(jù)的散點(diǎn)圖和直方圖，通過(guò)ModFit LT軟件顯示直方圖，分析得到樣品的二倍體階段（DIP）G0/G1（DNA靜止期/DNA合成前期）熒光值峰值和G0/G1熒光值峰的變異系數(shù)[27].該系數(shù)值小于3%，表示結(jié)果準(zhǔn)確;小于5%，表示基本正確;大于8%，表示結(jié)果不準(zhǔn)確[26].峰值及變異系數(shù)均能從ModFit LT軟件上直接讀出.最后通過(guò)比較樣品與標(biāo)樣的G0/G1熒光值峰值來(lái)計(jì)算核DNA C-值.

計(jì)算測(cè)試樣品的DNA 2C-值Q（體細(xì)胞中的DNA含量，單位：pg）：

其中，R為標(biāo)樣核DNA 2C-值，E為待測(cè)樣品的G0/G1熒光值峰值，S為標(biāo)樣的G0/G1熒光值峰值[28].

1.2.4 實(shí)驗(yàn)方法對(duì)蓑蘚屬樣品DNA C-值測(cè)定結(jié)果的影響

分別以小立碗蘚為標(biāo)樣（采用Galbraith 緩沖液），和以日本晴為標(biāo)樣（采用Otto緩沖液）測(cè)定了蓑蘚屬植物的DNA C-值.由于實(shí)驗(yàn)材料的緣故，以日本晴為標(biāo)樣的方法測(cè)定了3種蓑蘚屬的DNA C-值，以小立碗蘚為標(biāo)樣的方法測(cè)定了鈍葉蓑蘚和缺齒蓑蘚的DNA C-值.

1.2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用日本晴為標(biāo)樣和Otto緩沖液，對(duì)3種蓑蘚DNA C-值測(cè)定結(jié)果如表1所示，細(xì)胞核相對(duì)DNA含量直方圖如圖1所示.圖1中，DIP G1，DIP DNA合成后期G2和合成期S對(duì)應(yīng)熒光信號(hào)強(qiáng)度在x軸上用通道數(shù)（channel）表示，反映了樣品細(xì)胞的 DNA 相對(duì)含量，y軸對(duì)應(yīng)通道內(nèi)出現(xiàn)具有相同光信號(hào)特征性細(xì)胞核的數(shù)量.

用小立碗蘚為標(biāo)樣和Galbraith 緩沖液對(duì)鈍葉蓑蘚、缺齒蓑蘚DNA C-值測(cè)定結(jié)果見表2，細(xì)胞核相對(duì)DNA含量直方圖見圖2.

2 討 論

2.1 影響DNA C-值測(cè)定結(jié)果的因素分析

DNA C-值的檢測(cè)方法主要有化學(xué)分析法、Feulgen染色法[29]、復(fù)性動(dòng)力學(xué)法[30]，和近幾年興起的流式細(xì)胞術(shù)等4種方法.化學(xué)分析法在20世紀(jì)60年代之后就很少使用了;復(fù)性動(dòng)力學(xué)法在20世紀(jì)70年代之后幾乎不再使用了[31];福爾根染色法目前比較常用，但是該方法實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，結(jié)果不夠穩(wěn)定[32];流式細(xì)胞術(shù)是近年來(lái)受到重視的測(cè)定植物DNA C-值的方法.該方法應(yīng)用了流式細(xì)胞儀，綜合性高，涉及激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等多個(gè)領(lǐng)域的知識(shí)[33]，具有測(cè)量速度快、測(cè)量參數(shù)多的優(yōu)點(diǎn)，可以在1 s內(nèi)測(cè)定數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，能夠?qū)ν粋€(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，獲得的數(shù)據(jù)能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn).流式細(xì)胞術(shù)既能夠進(jìn)行細(xì)胞分析，也能夠進(jìn)行細(xì)胞的分選.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞核的熒光信號(hào)強(qiáng)度，并經(jīng)儀器自動(dòng)分析，DNA含量與熒光信號(hào)成正比關(guān)系.但是，流式細(xì)胞儀不同的生產(chǎn)廠家、不同的型號(hào)、不同的細(xì)胞核懸液，甚至樣品不同的生長(zhǎng)時(shí)期都可能會(huì)影響植物DNA C-值的測(cè)定結(jié)果[34].

BAINARD等[35]以苔蘚植物為材料開展流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定方法對(duì)DNA C-值檢測(cè)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)緩沖液、熒光染色時(shí)間、染色液濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果具有明顯影響.其中，以緩沖液類型和碘化丙啶染色液濃度的影響最大，分別會(huì)造成8%和14%的偏差.

方其等[36]以油菜（Brassica campestris）為材料，從標(biāo)樣、細(xì)胞核懸液、樣品生長(zhǎng)時(shí)期等方面研究了影響DNA C-值檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)因素.發(fā)現(xiàn)標(biāo)樣種類和樣品的生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有明顯影響，與Galbraith 緩沖液和Otto緩沖液相比，應(yīng)用Tris-MgCl2細(xì)胞核懸液能夠得到穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.本研究結(jié)果證實(shí)這兩種緩沖液也能夠獲得比較穩(wěn)定的結(jié)果.

在GREILLHUBER等[19]報(bào)道的232種蘚類植物DNA C-值為0.17～7.97 pg，平均值為0.66 pg，其中有135種（約占測(cè)定種數(shù)的58%）蘚類植物的DNA C-值為0.3～0.5 pg.本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的3種蓑蘚的DNA C-值在0.38～0.42 pg之間，而且數(shù)據(jù)的重復(fù)性好，標(biāo)準(zhǔn)誤差大小在0.001～0.020之間.用日本晴和小立碗蘚實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致，說(shuō)明兩種方法均可行.

2.2 蘚類植物DNA C-值研究的意義和展望

現(xiàn)有研究表明：蘚類植物的DNA C-值平均值在0.17～4.05 pg之間，明顯低于被子植物（平均為5.98 pg）[37];蘚類群之間DNA C-值變異幅度低于被子植物.RENZAGLIA等[17]認(rèn)為蘚類植物的核DNA 含量在進(jìn)化上受制于其雙鞭毛精子，因?yàn)楹薉NA 含量越大，精子體積越大，其運(yùn)動(dòng)能力越弱，越不利于受精作用，被子植物則不受這一因素影響.

苔蘚植物配子體占優(yōu)勢(shì)，又有原絲體、雙鞭毛精子、無(wú)維管束等有別于被子植物的性狀，在生態(tài)分布、繁育和傳播方式、生活型等方面也與被子植物不同.因此，苔蘚植物中DNA C-值的變異式樣，及其生態(tài)適應(yīng)、地理分布、分類學(xué)和進(jìn)化學(xué)上的意義肯定有別于被子植物，要闡明這些問(wèn)題，需要開展以下幾個(gè)方面工作.

1） 苔蘚植物約有2萬(wàn)種，是種數(shù)上僅次于被子植物的高等植物，但是關(guān)于苔蘚植物DNA C-值的研究才剛剛起步，世界范圍內(nèi)僅232種苔蘚植物有DNA C-值的數(shù)據(jù)資料[19]，例如木靈蘚科（Orthotrichaceae）、棉蘚科（Plagiotheciaceae）、錦蘚科（Sematophyllaceae）、塔蘚科（Hylocomiaceae）、縮葉蘚科（Ptychomitriaceae）等近半數(shù)科的蘚類植物還沒有任何DNA C-值數(shù)據(jù)，而蔓蘚科（Meteoriaceae）、叢蘚科（Pottiaceae）、真蘚科（Bryaceae）等世界性大科僅測(cè)定了個(gè)別或極少數(shù)種類[17].其次，測(cè)定過(guò)DNA C-值的種類中，有的采用了結(jié)果不太可靠的Feulgen染色法等.除了葫蘆蘚（Funaria hygrometrica Hedw.）等少數(shù)世界廣布種外，中國(guó)苔蘚植物的絕大部分種類沒有DNA C-值的數(shù)據(jù)資料.國(guó)內(nèi)也沒有任何有關(guān)苔蘚植物DNA C-值研究的報(bào)道.DNA C-值在苔蘚植物的變異式樣如何，是否具有進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育上的指示價(jià)值，要闡明這些問(wèn)題，需要系統(tǒng)地測(cè)定苔蘚植物的DNA C-值.

2） 雜交、染色體多倍化、漸變?nèi)含F(xiàn)象在苔蘚植物中比較普遍，造成了苔蘚植物的許多分類學(xué)問(wèn)題[38].但是，苔蘚植物個(gè)體細(xì)小，又不像被子植物有非?；钴S的根尖和莖尖分生組織，加上苔蘚植物染色體小，因此，影響了苔蘚植物的染色體研究和數(shù)據(jù)積累[39].應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)被子植物部分類群DNA C-值進(jìn)行測(cè)定和倍性分析，成功地處理了多倍體、雜交種的識(shí)別和疑難種的分類問(wèn)題.但是，還沒有在苔蘚植物學(xué)領(lǐng)域開展相應(yīng)的工作，這方面的工作有可能為苔蘚植物系統(tǒng)分類提供新的技術(shù)方法和分類學(xué)性狀.

3） 在被子植物中，DNA C-值在部分類群中有生物地理學(xué)和生態(tài)適應(yīng)上的意義.但是，有關(guān)苔蘚植物DNA C-值數(shù)據(jù)非常缺乏，已有的百余種苔蘚植物的DNA C-值數(shù)據(jù)，也由于前人測(cè)定方法的差異，樣品采集沒有考慮生境類型、繁育特點(diǎn)和地理分布等因素[18]，使一些結(jié)果缺乏可比性，無(wú)法進(jìn)行DNA C-值和生態(tài)、地理分布的相關(guān)分析.因此，需要通過(guò)對(duì)不同生態(tài)系統(tǒng)和地理區(qū)域的蘚類植物進(jìn)行DNA C-值的測(cè)定，解析苔蘚植物DNA C-值的生態(tài)適應(yīng)和生物地理學(xué)意義，探討應(yīng)用DNA C-值評(píng)估苔蘚植物地理分布和生態(tài)適應(yīng)特點(diǎn)的價(jià)值.

4） 苔蘚植物的DNA C-值明顯小于被子植物，RENZAGLIA將進(jìn)化上的選擇因素歸于苔蘚植物的雙鞭毛精子.但是，有相當(dāng)一部分苔蘚植物既有有性繁殖又有無(wú)性繁殖，而且有部分苔蘚植物類群不需要雙鞭毛精子，只通過(guò)無(wú)性繁殖來(lái)繁衍其種群[40].因此，有必要通過(guò)研究來(lái)探討繁殖方式對(duì)DNA C-值的影響，以期檢驗(yàn)RENZAGLIA觀點(diǎn)的正確性.

5） 內(nèi)多倍化（endopolyploidy）指細(xì)胞中的DNA進(jìn)行了復(fù)制，但是沒有伴隨著核的有絲分裂，結(jié)果形成了植物體組織或器官中細(xì)胞的不同倍性水平.BAINARD等[41]測(cè)定了46種苔蘚植物的核DNA含量，發(fā)現(xiàn)其中40種蘚類植物普遍存在著不同程度的內(nèi)多倍化現(xiàn)象，而其余6種苔類植物中幾乎沒有出現(xiàn)內(nèi)多倍化現(xiàn)象.本文作者發(fā)現(xiàn)小立碗蘚中存在明顯的出現(xiàn)內(nèi)多倍化現(xiàn)象，但是3種蓑蘚中卻沒有一種有內(nèi)多倍化現(xiàn)象.小立碗蘚是一種重要的分子生物學(xué)模式植物，先前報(bào)道該種只有2種倍性現(xiàn)象，但是本文作者測(cè)定發(fā)現(xiàn)存在明顯的單倍體、二倍體和四倍體現(xiàn)象.本實(shí)驗(yàn)所采用的小立碗蘚標(biāo)樣采自云南昆明宜良縣，是否反映了該種是小立碗蘚的一個(gè)特殊種群，值得進(jìn)一步研究.

參考文獻(xiàn)：

[1] SOLTIS D E，SOLTIS P S，BENNETT M D.Evolution of genome size in the angiosperms [J].American Journal of Botany，2003，90（11）：1596-1603.

[2] FLAVELL R B.The molecular characterization and organization of plant chromosomal DNA sequences [J].Annual Review of Plant Physiology，1980，31：569-596.

[3] CAVALIER-SMITH T.Eukaryote gene numbers，non-coding DNA and genome size [M]//The Evolution of Genome Size.Chichester，Britain：John Wiley & Sons，1985：69-103.