響應(yīng)面優(yōu)化酸性染料法測(cè)定走馬胎總生物堿含量條件*

周澤建

(1.中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京100081;2.廣西生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 柳州545004)

0 引言

走馬胎Ardisia gigantifolia Stapf為紫金牛科紫金牛屬，是一種珍貴的民族藥用植物.它具有祛風(fēng)濕、活血止痛、生肌化毒、壯筋活絡(luò)等功效，主要用于風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、痛經(jīng)等南方常見(jiàn)疾病的治療.[1]現(xiàn)代藥理研究表明，走馬胎具有抗腫瘤、抗氧化、抗血栓等生物活性.[1]走馬胎的活性成分主要有多糖、三萜皂苷類、生物堿.[2]定量測(cè)定生物堿的含量有很多種方法，如滴定法、[3]酸性染料法、[4]薄層色譜分析法、[5-7]高效液相色譜分析法、[8]酶聯(lián)免疫分析法、[9]儀器聯(lián)用分析法、[10]高效毛細(xì)管電泳分析法[11]及近紅外光譜分析法.[12]其中，酸性染料法具有簡(jiǎn)單易操作、結(jié)果可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于總生物堿含量的測(cè)定.相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果表明，影響酸性染料法的因素主要有酸性染料用量、酸性染料p H值、靜置時(shí)間.[2，13-15]因此，本研究對(duì)酸性染料用量、酸性染料p H值、靜置時(shí)間進(jìn)行考察，考察其對(duì)生物堿吸光度值的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化酸性染料法的測(cè)定條件，為走馬胎質(zhì)量控制方法提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

走馬胎采自廣西生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院溫室大棚，洗凈、晾干后，在60℃下烘干至恒重，粉碎，過(guò)200目篩子備用.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

無(wú)水乙醇、硫酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、溴甲酚綠、氯仿均為國(guó)產(chǎn)分析純;氧化苦參堿對(duì)照品(編號(hào)：GR0837)購(gòu)自南京廣潤(rùn)生物制品有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

AUW-D型電子分析天平(日本島津);IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA公司);恒溫水浴鍋(常州儀器制造公司);低溫冷凍超速離心機(jī)(日本日立公司);紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司).

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 走馬胎總生物堿提取液的制備

精密稱取走馬胎2 g，加20倍90%乙醇，加熱回流提取2 h，過(guò)濾得濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏.浸膏用2%硫酸溶解，合并酸水溶液，離心得上清液.上清液以5 mol.L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)p H值至9～10，等體積氯仿萃取三次.合并萃取液，濃縮至10 ml，備用.

1.4.2 試劑的配制

準(zhǔn)確稱取氧化苦參堿對(duì)照品7.3 mg，用無(wú)水乙醇溶解后定容至50 ml，配成0.146 mg.ml-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，存4℃冰箱備用;精密稱取磷酸二氫鉀6.8045 g和氫氧化鈉1.6880 g，溶于超純水后定容至1000 ml，配成p H值大約等于7.6的磷酸緩沖液.準(zhǔn)確稱取溴甲酚綠0.1000 g，用磷酸緩沖液超聲溶解后定容至200 ml，配成酸性染料溶液.

1.4.3 測(cè)定方法

精密吸取氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.6 ml，揮干后加入適量、適宜的p H值酸性染料，振搖1 min，然后加入氯仿10 ml置于分液漏斗中，振搖1 min后靜置適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，取氯仿層加入0.2 g的無(wú)水硫酸鈉，同時(shí)以試劑作為空白，于400 nm處測(cè)定其的吸光度值.

1.4.4 顯色條件的單因素實(shí)驗(yàn)

影響酸性染料法測(cè)定總生物堿的主要因素有酸性染料用量、酸性染料p H值、靜置時(shí)間等.因此，本文采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察此3個(gè)因素對(duì)走馬胎總生物堿測(cè)定的影響.吸光度值按1.4.3測(cè)定.

1.4.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken Design(BBD)設(shè)計(jì)原理，選取酸性染料用量、酸性染料p H值、萃取時(shí)間作為三個(gè)因素變量，對(duì)此三個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以吸光值為響應(yīng)值，各因素的三水平用-1、0、1進(jìn)行編碼，[16]如表1.

1.4.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試樣品溶液0.8 ml 5份，按照1.4.5得出的最優(yōu)條件進(jìn)行顯色實(shí)驗(yàn)，于400 nm處測(cè)定吸光度值.計(jì)算其結(jié)果的RSD值.

1.4.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試樣品溶液0.8 ml，按照響應(yīng)面優(yōu)化的顯色條件進(jìn)行顯色實(shí)驗(yàn)，于400 nm處測(cè)定吸光度值.每隔0.5 h測(cè)定1次，共測(cè)5次.計(jì)算其結(jié)果的RSD值.

1.4.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精確稱取同一批走馬胎2.00 g 5份，按照1.4.1制備供試樣品溶液.采用響應(yīng)面優(yōu)化的顯色條件，按照1.4.3法測(cè)定供試樣品溶液的吸光度.計(jì)算其結(jié)果的RSD值.

1.4.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依次精密吸取氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.60 ml、0.80 ml、1.00 ml，揮干后采用響應(yīng)面優(yōu)化的顯色條件，按照1.4.3法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中氧化苦參堿含量為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.

1.4.10 樣品測(cè)定與加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

從1.4.1制備的備用液精確量取0.40 ml 11份，前5份不加氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余6份加標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20 ml，揮干后采用響應(yīng)面優(yōu)化的顯色條件，按照1.4.3法測(cè)定溶液的吸光度.計(jì)算其回收率.

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)水平與編碼Tab.1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel預(yù)處理后，運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行方差分析，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

在300～500 nm之間，對(duì)樣品和對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描.掃描結(jié)果如圖1所示，樣品和對(duì)照品溶液都在400 nm處有最大吸收峰.因此，選擇400 nm為測(cè)定波長(zhǎng).

圖1 光譜掃描圖Fig.1 UV-visible spectrum chromagrams

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酸性染料用量對(duì)吸光度的影響

由圖2中C可以看出，除了酸性染料用量5 ml外，隨著其用量的增加，樣品吸光度逐漸增大，在用量為7 ml處達(dá)到最大，此后逐漸減少.因此，選擇酸性染料用量7 ml為最佳比色條件.

2.2.2 p H值對(duì)吸光度的影響

樣品吸光度隨著p H值的增大而增大，在p H=7.6時(shí)達(dá)到最大(圖2中B).因此，p H值確定為7.6左右.

2.2.3 靜置時(shí)間對(duì)吸光度的影響

圖2 三種因素對(duì)吸光度的影響Fig.2 Effect of acid dosage，p H and standing time on sample's absorbance

由圖2中A得出，隨著靜置時(shí)間的增加，樣品吸光度出現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象，在靜置時(shí)間為1.5 h處出現(xiàn)峰值.因此，靜置時(shí)間定為1.5 h左右.

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 模型的建立與檢驗(yàn)

以吸光度為響應(yīng)值，采用Design-Expert 7.0軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行ANOVA分析，得出結(jié)果如表3所示.對(duì)表3所示的系數(shù)進(jìn)行多元化擬合回歸，得回歸方程如下：

表2 走馬胎生物堿響應(yīng)面設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Response surface design matrix with experimental and predicted values of total alkaloid content of Ardisia gigantifolia Stapf

表3 回歸方程的方差分析表Tab.3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

所得模型具有極顯著(p＜0.01)，相關(guān)系數(shù)R2為0.9717，調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2adj為0.9208，變異系數(shù)CV＜10%，并且模型失擬不顯著(p＞0.05)(表3).這些數(shù)據(jù)充分證明該模型顯著，所獲得的二次回歸方程在酸性染料法測(cè)定走馬胎生物堿過(guò)程中擬合較好，能充分說(shuō)明走馬胎生物堿測(cè)定過(guò)程，因而可以利用該模型進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化設(shè)計(jì).由表3可以得出：一次項(xiàng)A、C具有極顯著性(p＜0.01);交互項(xiàng)AC和二次項(xiàng)C2具有顯著性(p＜0.05).綜合三種因素的F值，可以得出影響測(cè)定走馬胎生物堿因素的重要性大小順序?yàn)镃＞A＞B，即緩沖液p H值＞靜置時(shí)間＞酸性染料用量.

2.3.2 顯色條件的優(yōu)化

以響應(yīng)值最大值為目的，運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件對(duì)模型參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳測(cè)定走馬胎生物堿條件：靜置時(shí)間2 h;酸性用量6.93 ml;緩沖液p H=7.20.據(jù)此優(yōu)化條件測(cè)定走馬胎生物堿，吸光度值可以達(dá)到0.449.酸性染料用量對(duì)模型不存在顯著影響，結(jié)合實(shí)踐可操作性，可以把酸性染料用量修正為7.00 ml.按照此修正條件，進(jìn)行5次平行試驗(yàn).試驗(yàn)結(jié)果如下：0.445、0.427、0.440、0.459、0.449，平均值為0.444，RSD為2.70%.該平行試驗(yàn)所測(cè)得的平均值0.444與模型理論值0.449相差不大，沒(méi)有達(dá)到顯著性水平.說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性，精密度較好，所選的測(cè)定條件較為理想，可以作為酸性染料法測(cè)定走馬胎生物堿的顯色條件.

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

顯色測(cè)第一次吸光值后，每隔0.5 h測(cè)1次，共測(cè)6次.所測(cè)得的6次吸光值依次為：0.461、0.453、0.443、0.443、0.443、0.438，平均值為0.447，RSD為1.89%.這些數(shù)據(jù)充分證明供試樣品溶液顯色后的吸光度值在2.5 h之內(nèi)基本穩(wěn)定，可滿足基本的測(cè)定要求.

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照響應(yīng)面優(yōu)化的條件進(jìn)行顯色后，同批次的5份走馬胎樣品溶液的吸光度值為0.457、0.434、0.434、0.462、0.446、0.438，平均值為0.445，RSD為2.70%.說(shuō)明酸性染料法在此優(yōu)化顯色條件下重現(xiàn)性較好，所得的數(shù)據(jù)可靠.

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液中生物堿含量在0.0146～0.146 mg之間與吸光度存在較好線性關(guān)系，線性方程為y=4.8462x+0.016，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994.

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve

2.3.6 樣品的測(cè)定和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

由表4，5份空白樣品溶液(不加入標(biāo)準(zhǔn)溶液)含生物堿的量為0.0650 mg、0.0639 mg、0.0620 mg、0.0592 mg、0.0638 mg，平均值為0.0628 mg，RSD值為3.66%，說(shuō)明該法在優(yōu)化的顯色條件下測(cè)定走馬胎生物堿含量可行，精密度較好.6份加標(biāo)溶液的回收率為97.99%、91.27%、102.30%、93.75%、95.16%、99.89%，平均值為96.73%，RSD值為3.66%.這些數(shù)據(jù)充分體現(xiàn)了酸性染料法在響應(yīng)面優(yōu)化的條件下測(cè)定走馬胎生物堿含量是可行、可靠，準(zhǔn)確度高.

表4 樣品和回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 The result of recovery test and Ardisia gigantifolia Stapf's determination

3 結(jié)論與討論

該實(shí)驗(yàn)基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken Design(BBD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化顯色條件，得出最佳實(shí)驗(yàn)測(cè)定條件如下：靜置時(shí)間為2 h;酸性用量7 ml;緩沖液p H=7.20.在此條件下測(cè)定同批次走馬胎生物堿含量準(zhǔn)確度高，平均加標(biāo)回收率為97.99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.23%.該法簡(jiǎn)單易操作、迅速、低成本、準(zhǔn)確度較高，適用于走馬胎總生物堿的測(cè)定，同時(shí)也適合一般生物堿的測(cè)定.

其他中藥材總生物堿的測(cè)定條件(靜置時(shí)間、緩沖液p H值)和本實(shí)驗(yàn)所優(yōu)選出的條件相異，[17-19]這可能是沒(méi)有考慮各因素之間的交互作用所致.由表3可知，靜置時(shí)間與緩沖液p H值存在顯著性交互作用.因此，本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面優(yōu)選的測(cè)定條件是可行、可靠的，適用于一般總生物堿的測(cè)定.