不同類型熱處理方式對(duì)牛乳品質(zhì)的影響

王象欣，張秋梅，魏雪冬，姜毓君，徐琳，鄂來(lái)明

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱150028）

0 引 言

牛奶熱處理的主要目的是為了殺死微生物和滅活酶，熱處理的有效性和其對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響主要與溫度-時(shí)間的組合、使用的加熱方式和牛奶的預(yù)處理?xiàng)l件有關(guān)[1-4]。目前，已經(jīng)提出了幾種用于評(píng)估牛奶熱處理程度的方法，如使用熱處理時(shí)間-溫度組合的曲線積分（Time Temperature Integrators,TTIs）作為熱處理指數(shù)[5]。最常用的是堿性磷酸酶(ALP,EC 3.1.3.1)和乳過(guò)氧化物酶(Lpo,EC 1.11.1.7)的測(cè)定，其中ALP的活性作為一種熱處理強(qiáng)度指數(shù)廣泛用于評(píng)價(jià)牛奶巴氏殺菌是否徹底[6]，Lpo的活性用于區(qū)分巴氏殺菌牛奶。歐洲提議對(duì)未變性β-Lg的定量測(cè)定數(shù)值作為巴氏殺菌牛奶的熱處理上限[7]，巴氏殺菌牛奶中的未變性β-Lg濃度最低為2 600 mg/L，低于其數(shù)值說(shuō)明已超過(guò)相應(yīng)的熱處理工藝上限，其產(chǎn)品不符合巴氏殺菌牛奶的品質(zhì)要求。美國(guó)Grade A規(guī)范中[8]，針對(duì)牛奶熱處理的工藝和設(shè)備，檢測(cè)指標(biāo)高達(dá)40多項(xiàng)，并且與牛奶品質(zhì)和安全相關(guān)的裝置及設(shè)備必須要使用鉛封，這也同時(shí)說(shuō)明了熱處理工藝的重要性。不同熱處理工藝對(duì)牛奶中熱敏性活性蛋白α-乳白蛋白（α-lactoalbumin，α-Lac）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）和乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）的影響尚未得到廣泛研究。本研究的目的是通過(guò)對(duì)不同熱處理?xiàng)l件下熱敏性活性蛋白α-Lac、β-Lg和Lf的測(cè)定，來(lái)對(duì)比牛奶的熱損傷。

1 材料與方法

1.1 牛奶樣品的采集

保質(zhì)期為12個(gè)月的UHT工藝牛奶20種（標(biāo)記為UHT-1），保質(zhì)期為1~6個(gè)月的UHT工藝牛奶20種（標(biāo)記為UHT-2），巴氏殺菌牛奶15種，每種10個(gè)批次。以上樣品來(lái)自11個(gè)省份、自治區(qū)、直轄市的大型超市，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)抽取試驗(yàn)所用樣品。INF工藝牛奶為實(shí)驗(yàn)室自制，4個(gè)批次。

1.2 樣品熱處理方式

目前乳品工業(yè)中常用的熱處理方法見(jiàn)表1所示[3,8,11]。蒸汽浸入式直接殺菌（direct steam Infusion，INF）牛奶為實(shí)驗(yàn)室自制，溫度為143~158℃，殺菌時(shí)間為0.05~0.5 s。INF殺菌是目前國(guó)際上一種先進(jìn)的殺菌方式，它將牛奶勻速的通過(guò)小孔型分配板進(jìn)入相對(duì)靜止的蒸汽罐中，當(dāng)牛奶自由下落時(shí)與蒸汽融合，牛奶溫度升高，進(jìn)而達(dá)到了殺菌的效果。而且在此過(guò)程中，可以對(duì)牛奶溫度、蒸汽溫度實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的控制，可使牛奶的殺菌溫度與蒸汽溫度之間的溫差達(dá)到1℃，因此產(chǎn)品中的維生素，乳球蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞程度小，營(yíng)養(yǎng)成分保留更高，產(chǎn)品口感新鮮[12]。工藝流程如下。

生鮮牛乳收集→預(yù)熱（65~68℃）→殺菌（143~158℃）→真空冷卻脫氣→均質(zhì)（64~66℃，20 MPa）→冷卻（10℃）→成品

表1 乳品加工中常用的熱處理方式

1.3 分析方法

α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白的檢測(cè)方法為本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部方法，并且參照GB/T 27417-2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》對(duì)方法進(jìn)行了確認(rèn)，滿足標(biāo)準(zhǔn)各項(xiàng)要求。

1.3.1 乳鐵蛋白

稱取10 g（精確至0.01 g）牛奶樣品于100 mL三角瓶中，先加入30 mL結(jié)合緩沖液（84 mmol/L Na2HPO4，16 mmol/L NaH2PO4），渦旋振蕩混勻1 min，將樣品全部轉(zhuǎn)移至容量瓶，再加入結(jié)合緩沖液定容至50 mL后混勻；將樣本轉(zhuǎn)移至離心管于4℃條件下以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，離心后輕輕取出中間層，上層有脂質(zhì)，下面有沉淀，用大量程的移液器將中間液體部分吸出，注意不要吸取上層脂質(zhì)和下層沉淀。取其中的10 mL作為樣品提取液。

肝素親和柱先加入5 mL結(jié)合緩沖溶液（84 mmol/L Na2HPO4，16 mmol/L NaH2PO4）平衡，處理完畢后加入樣品提取液，待樣液完全流出后，再用10 mL淋洗液（42 mmol/L NaH2PO4），8 mmol/L NaH2PO4），100 mmol/L NaCl）淋洗，棄去全部流出液。最后用2.5 mL洗脫液（42 mmol/L NaH2PO4），8 mmol/L NaH2PO4），1 mol/L NaCl）洗脫，收集全部流出液，定容至3.5 mL。將收集溶液過(guò)濾膜，供液相色譜檢測(cè)分析用。通過(guò)BEH300 C4色譜柱（Waters，100 mm×2.1 mm，1.7μm，300?）進(jìn)行分離。梯度洗脫，流動(dòng)相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液；流動(dòng)相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈；梯度條件見(jiàn)表2所示，流速為0.3 mL/min，柱溫為60℃，進(jìn)樣量為10μL；通過(guò)紫外檢測(cè)器280 nm下進(jìn)行檢測(cè)。

表2 乳鐵蛋白梯度洗脫條件

1.3.2α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

取5 g（精確至0.01 g）牛奶樣品至50 mL離心管中，加入15.0 mL水混勻，加入冰醋酸（約30μL）調(diào)節(jié)pH為4.6±0.1左右，渦旋震蕩1 min，室溫靜置至少20 min后，在10 000轉(zhuǎn)，4℃條件下離心10 min。取1 mL上清液稀釋10倍后，過(guò)0.22μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)。通過(guò)BEH 300 C4色譜柱（Waters,100 mm×2.1 mm，1.7μm，300?）進(jìn)行分離。梯度洗脫，流動(dòng)相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液；流動(dòng)相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈；梯度條件見(jiàn)表3所示，流速為0.3 mL/min，柱溫為60℃，進(jìn)樣量為10μL；通過(guò)紫外檢測(cè)器280 nm下進(jìn)行檢測(cè)。

表3 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白梯度洗脫條件

1.4 結(jié)果分析方法

所得數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于分析處理所得的數(shù)據(jù)，根據(jù)GB/T 6379.2-2004《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第二部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》中的相關(guān)公式，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)值偏差CV%（變異系數(shù)），并用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性校驗(yàn)，P<0.5表示顯著性差異，P>0.5表示無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果和討論

2.1 對(duì)不同工藝熱處理牛奶的結(jié)果分析

熱處理的評(píng)估基于圖1，圖2中的色譜圖和表4中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，圖1中β-Lg A和β-Lg B為β-Lg的兩種遺傳變異體。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同的熱處理方式，牛奶中α-Lac、β-Lg和Lf含量差異顯著。

UHT滅菌工藝牛奶中Lf含量均小于檢出限（見(jiàn)表4所示），熱處理后α-Lac和β-Lg的含量和未經(jīng)過(guò)熱處理的生乳比較已經(jīng)大量減少，其中UHT-1滅菌牛奶α-Lac的含量最低為63 mg/L，β-Lg的含量最低為69mg/L；UHT-2滅菌牛奶α-Lac的含量最低為69 mg/L，β-Lg的含量最低為102 mg/L。UHT-2滅菌牛奶中α-Lac和β-Lg的含量平均值高于UHT-1滅菌牛奶，說(shuō)明UHT-1滅菌牛奶熱處理強(qiáng)度高于UHT-2滅菌牛奶，因此從營(yíng)養(yǎng)角度來(lái)說(shuō)，UHT-2滅菌牛奶優(yōu)于UHT-1滅菌牛奶。UHT-1滅菌牛奶的保質(zhì)期均為常溫下一年，高于UHT-2滅菌牛奶的常溫1~6個(gè)月，因此UHT-1滅菌牛奶需要更高的熱處理強(qiáng)度才能滿足其貨架期需要。比較兩種UHT滅菌牛奶中α-Lac和β-Lg含量的CV%（變異系數(shù)）均大于40%，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性校驗(yàn)結(jié)果為P<0.5，說(shuō)明UHT滅菌牛奶間品質(zhì)差異明顯。

抽取的市售15種巴氏殺菌牛奶中，α-Lac含量最大值為963 mg/L，最小值為624 mg/L；β-Lg含量最大值為3 557 mg/L，最小值為1 548 mg/L；Lf含量最大值為38 mg/L，最小值為12 mg/L。15種巴氏殺菌牛奶樣品中，5種樣品的β-Lg含量小于2 600 mg/L，說(shuō)明其加熱程度超過(guò)了巴氏殺菌的加熱上限[7]，原因或?yàn)檠娱L(zhǎng)貨架期，但對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有一定的影響。巴氏殺菌工藝牛奶的β-Lg和Lf的含量CV%均大于20%，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性校驗(yàn)結(jié)果為P<0.5，可以判巴氏殺菌工藝牛奶品質(zhì)間的差異很大，加熱強(qiáng)度高低對(duì)牛奶品質(zhì)影響顯著。

圖1 牛奶樣品中α-Lac和β-Lg的色譜圖

圖2 牛奶樣品中Lf的色譜圖

2.2 蒸汽浸入式直接殺菌（INF）牛奶

本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了來(lái)自3個(gè)不同牧場(chǎng)的生乳中α-Lac、β-Lg和Lf的含量（表5所示），其中未經(jīng)處理的生乳中β-Lg的含量高于Claeys等報(bào)道的3 300~3 500 mg/L的平均值[13]；α-Lac的含量低于Jeanson等報(bào)道的1 310~1 840 mg/L的平均值[14]。Lf的含量與Riechel等報(bào)道的檢測(cè)結(jié)相當(dāng)[9]，低于Harmon等報(bào)道的檢測(cè)結(jié)果[10]。

表4 不同熱處理?xiàng)l件下未變性α-Lac、β-Lg、Lf的含量

成品中α-Lac，β-Lg和Lf的含量檢測(cè)見(jiàn)表5，觀察到α-Lac的變性率（處理后變性α-Lac占處理前α-Lac的百分比）為24.9%，β-Lg的變性率為39.5%，Lf的變性率最高，為78.7%，與文獻(xiàn)中報(bào)道的變性率相當(dāng)[15-16]。也可以判斷出3種活性蛋白的熱敏感順序?yàn)椋篖f<β-Lg<α-Lac。

試驗(yàn)使用的生乳來(lái)自牧場(chǎng)3，按照1.1所述INF殺菌進(jìn)行處理，并在預(yù)熱、殺菌、均質(zhì)、成品4個(gè)工藝階段取樣，冰水浴快速降溫，檢測(cè)α-Lac，β-Lg和Lf的含量，結(jié)果見(jiàn)表6所示，可以看出隨著熱處理強(qiáng)度的增大，α-Lac，β-Lg和Lf的含量均有一定減少。通過(guò)對(duì)處理后未變性α-Lac，β-Lg和Lf的含量與生乳中α-Lac，β-Lg和Lf的含量的比率作圖（圖3所示），可以觀察到，殺菌后α-Lac剩余77.2%、β-Lg剩余61.7%、Lf僅剩余21.4%，成一定趨勢(shì)。

表5 生乳和蒸汽浸入式直接熱處理殺菌牛奶中未變性α-Lac、β-Lg、Lf的含量（n=10）

表6 工藝不同階段未變性α-Lac、β-Lg、Lf的含量（n=10）

圖3 工藝不同階段未變性α-Lac、β-Lg、Lf比率趨勢(shì)圖

INF殺菌工藝因?yàn)榕c加熱介質(zhì)（蒸汽）的直接接觸，然后通過(guò)真空立即冷卻，熱傳遞效率高，從而限制了由于過(guò)量熱暴露而導(dǎo)致的產(chǎn)品質(zhì)量損失。比較殺菌階段的時(shí)間-溫度曲線下的面積[5]，也可以說(shuō)明生乳在這幾種工藝下總的熱暴露，INF殺菌的熱暴露最小，對(duì)牛奶的熱損傷最小，其優(yōu)于管式或板式熱交換的間接加熱。蒸汽的直接熱傳遞由于不存在傳熱表面，也極大的減少了熱損傷和結(jié)渣。Lee和Sherbon[17]的研究指出，與熱處理前均質(zhì)比較，熱處理后再均質(zhì)的牛奶中α-Lac和β-Lg的含量更高，說(shuō)明均質(zhì)和熱處理的順序可能對(duì)牛奶中活性蛋白的含量產(chǎn)生影響。熱處理使乳清蛋白變性，其可共價(jià)結(jié)合到酪蛋白膠束的表面或天然乳脂肪球膜上。加熱處理減少了乳脂肪球膜上的游離巰基，增加了其上面的二硫鍵，也說(shuō)明β-Lg是通過(guò)二硫鍵與與膜蛋白結(jié)合[17]。均質(zhì)使脂肪球破裂變小，乳脂肪球膜上更多活性位點(diǎn)（游離巰基）得到釋放，均質(zhì)后熱處理使乳脂肪球膜更易結(jié)合α-Lac和β-Lg。而本試驗(yàn)工藝為熱處理后真空脫氣冷卻后均質(zhì)，冷卻過(guò)程使反應(yīng)活化能降低，α-Lac和β-Lg不易與乳脂肪球膜結(jié)合。

2.3 不同熱處理方式的比較

根據(jù)圖4可以分析出不同熱處理方式對(duì)牛奶中熱敏性天然活性蛋白的含量有顯著影響，INF工藝優(yōu)于UHT滅菌，與巴氏殺菌相當(dāng)（P>0.5），INF工藝在延長(zhǎng)保質(zhì)期的同時(shí)（低溫條件21 d），降低了對(duì)牛奶的熱損傷。UHT滅菌牛奶的過(guò)熱加工和長(zhǎng)期保存，在一定程度上降低了牛奶的品質(zhì)。

圖4 不同工藝牛奶中活性蛋白含量平均值對(duì)比圖

3 結(jié) 論

通過(guò)比較不同方式熱處理的牛奶與INF殺菌牛奶中α-Lac，β-Lg和Lf的含量，得出INF殺菌對(duì)牛奶中的α-Lac，β-Lg和Lf的熱損傷程度低于UHT滅菌（P<0.5），與巴氏殺菌相當(dāng)（P>0.5），其產(chǎn)品的保質(zhì)期在冷藏條件下可達(dá)到21 d，貨架期高于巴氏殺菌牛奶。通過(guò)對(duì)不同工藝熱處理?xiàng)l件下數(shù)據(jù)的變異系數(shù)進(jìn)行分析，可以判斷出巴氏殺菌牛奶、保質(zhì)期12個(gè)月的UHT工藝牛奶和保質(zhì)期1~6個(gè)月的UHT工藝牛奶，其品質(zhì)間差異都很大，所以需要嚴(yán)格控制牛奶的熱處理工藝，盡可能對(duì)牛奶中的功能性成分天然活性蛋白含量最大保留。同時(shí)，應(yīng)當(dāng)建立相應(yīng)的檢測(cè)方法，監(jiān)控市售牛奶產(chǎn)品中的活性蛋白成分含量，以加強(qiáng)對(duì)液態(tài)奶過(guò)熱加工的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。