沙利度胺影響腫瘤壞死因子受體表達對大鼠慢性坐骨神經(jīng)縮窄的鎮(zhèn)痛效應

蘇曉英 陳素明 周飛仁 王清秀

(1綿陽市第三人民醫(yī)院 四川省精神衛(wèi)生中心，四川 綿陽 621000；2同濟大學醫(yī)學院附屬上海市東方醫(yī)院麻醉科)

凡涉及軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而引起的慢性疼痛即神經(jīng)病理性疼痛(NP)〔1〕，其臨床表現(xiàn)以疼痛過敏、感覺異常、自發(fā)性疼痛等為主要癥狀，患者常因劇烈疼痛而痛苦不堪〔2,3〕。對于NP的發(fā)病機制，目前國內(nèi)外的探究熱點主要圍繞分子神經(jīng)生物學機制，包括炎癥介質作用、中樞敏化、中樞去抑制等〔4,5〕。其中，炎癥介質作用中研究較為普遍的是細胞因子腫瘤壞死因子(TNF)〔6〕，而TNF受體(TNFR)的表達來體現(xiàn)其效應高低〔7,8〕?？梢姡w內(nèi)TNFR(包括TNFR1、TNFR2)表達水平與NP發(fā)病密切相關，在傷害性信號傳導通路中起關鍵作用。沙利度胺曾因其強致畸作用引起新生兒先天性四肢殘缺而一度被禁用，現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)在一定劑量下，沙利度胺具有鎮(zhèn)靜止癢、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多方面的作用〔9,10〕。沙利度胺可減弱TNFR1、TNFR2 mRNA及蛋白的表達并調(diào)節(jié)TNF誘導的其他細胞因子分泌〔11〕，減輕炎癥反應，這極可能與其鎮(zhèn)痛機制相關。而目前沙利度胺與TNFR表達對NP的鎮(zhèn)痛作用尚未得到驗證，其劑量效應關系需要進一步探究。本文擬分析慢性坐骨神經(jīng)縮窄(CCI)大鼠不同劑量下沙利度胺對TNFR表達水平的影響，以評估沙利度胺與TNFR的鎮(zhèn)痛效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 清潔級成年雄性SD大鼠50只，體重200～250 g，購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司。隨機分為5組各10只：假手術組(S組)、CCI組(C組)、低劑量沙利度胺組(L組)、中劑量沙利度胺組(M組)、高劑量沙利度胺組(H組)。S組暴露坐骨神經(jīng)不結扎，其余4組建造CCI模型。

1.2大鼠CCI模型建造 實驗大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，固定于手術臺并確保器械消毒；在大鼠右下肢股后中部切開皮膚，沿肌肉紋理鈍性分離股二頭肌進而暴露坐骨神經(jīng)干。近分叉處采用鉻制腸線做4個疏松結扎，每個結扎環(huán)間距大約1 mm。結扎程度以大鼠大腿肌肉輕微抽出為標準，不影響血管血運。創(chuàng)面消毒沖洗后逐層縫合，術后分籠喂養(yǎng)。

1.3術后處理 根據(jù)預實驗結果，L組劑量20 mg/kg，M組50 mg/kg，H組100 mg/kg；采用固定灌胃器每日1次處理實驗大鼠，術后灌胃持續(xù)1 w。

1.4大鼠機械性痛閾與熱痛閾測定 機械性痛閾測量：所有大鼠于手術前，手術后1、2、3及4 w測定并記錄其機械性痛閾與熱痛閾。機械性痛閾采用von Frey纖維，使尼龍纖維毛垂直刺激大鼠右足底皮膚，逐漸加壓，刺激持續(xù)時間不超過4 s；陽性反應為大鼠出現(xiàn)添足、縮足、抬足等躲避行為，反之為陰性反應，以出現(xiàn)陽性反應的壓力值為機械性痛閾。操作重復5次，取其平均值。

熱痛閾測量：熱痛閾以紅外線為輻射源，將實驗大鼠置于輻射熱測痛儀中，穩(wěn)定5 min后，紅外線照射大鼠右側足底部皮膚，記錄大鼠出現(xiàn)縮足的潛伏期并防止過度輻射燙傷大鼠。重復操作3次，每次間隔10 min，取平均值。

1.5TNFR表達產(chǎn)物測定 于手術后第4周，處死所有實驗大鼠，取其脊髓背角組織，測定其TNFR1、TNFR2 mRNA及蛋白質含量。

1.5.1Western印跡檢測TNFR蛋白含量 采用GE蛋白印跡系列儀器，一抗TNFR1、TNFR2單克隆抗體及二抗辣根過氧化物酶標記單克隆抗體購于碧云天生物有限公司。

脊髓背角組織經(jīng)機械分散后溶于十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠加樣緩沖液，于4℃，1 200 r/min離心15 min，取上清液作為檢測樣品并按常規(guī)方法進行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE)；用轉膜緩沖液平衡5 min后轉膜，將蛋白質從凝膠轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；加入封閉液(5%脫脂牛奶)室溫下封閉2 h；棄封閉液，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜3次，每次5 min；浸入第一抗體溶液液(稀釋1∶1 000)TNFR1、TNFR2兔抗人單克隆抗體，4℃反應12 h；次日棄一抗，0.01 mol/L PBS洗膜，加入辣根過氧化物酶二抗稀釋液，室溫下反應1 h。以β-actin蛋白為內(nèi)參蛋白，分析4組蛋白相對表達量。

1.5.2實時熒光定量PCR測定TNFR mRNA含量 采用ABI stepone Real-time PCR儀，總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購于北京天根有限公司。Trizol試劑提取組織上清液樣本總RNA，加入等體積異丙醇后振蕩混勻，離心10 min，收集沉淀。75%乙醇清洗沉淀，超凈臺風干，而后用焦碳酸二乙酯(DEPC)溶解，逆轉錄合成cDNA。選用β-actin為內(nèi)參基因，檢測各組TNFR1、TNFR2 mRNA的Ct值，運用公式2-△△CT計算4組目的基因的相對表達量，操作重復3次。實驗中，內(nèi)參基因及各目的基因引物序列如表1。

1.6統(tǒng)計方法 應用SPSS19.0軟件進行重復測量方差分析和Pearson相關性分析。

表1 實時熒光定量PCR檢測TNFR基因表達的引物序列

2 結 果

2.1術后不同時間點下各組機械性痛閾與熱痛閾的變化 S組在術前術后的機械性痛閾與熱痛閾均無明顯改變(P>0.05)，其余4組術后痛閾、熱閾均有明顯下降(P<0.05)；C組術后第4周時機械性痛閾較術后第1周明顯升高(P<0.05)，而術后其他時間點下的機械性痛閾與術后各時間點的熱痛閾無明顯差異(P>0.05)；L組、M組、H組在術后機械性痛閾、熱痛閾隨時間呈上升趨勢(P<0.05)。術后C組對比S組，機械性痛閾與熱痛閾明顯降低(P=0.000)；C組術后的機械性痛閾、熱痛閾顯著低于L組(P<0.01)；機械性痛閾、熱痛閾相比，H組顯著高于M組(P=0.000)，M組顯著高于L組(P=0.000)，見表2。

2.24組TNFR1、TNFR2 mRNA及蛋白相對表達 與C組比較，L組、M組及H組TNFR1 mRNA和蛋白含量均明顯降低(P<0.05)；H組TNFR1基因表達產(chǎn)物含量最低，其次為M組，L組相比于前兩組，TNFR1 mRNA與蛋白表達水平略高(P<0.05)；而各組TNFR2基因表達產(chǎn)物，mRNA與相應蛋白含量無明顯差別(P>0.05)，見表3、圖1。

表2 各組不同時間機械性痛閾、熱痛閾測量值

機械性痛閾F①-②組內(nèi)=15.103,P①-②組內(nèi)=0.000;F②-③組內(nèi)=7.287,P②-③組內(nèi)=0.000;F③-④組內(nèi)=6.432,P③-④組內(nèi)=0.000；F④-⑤組內(nèi)=8.045,P④-⑤組內(nèi)=0.000；熱痛閾：F①-②組內(nèi)=11.651,P①-②組內(nèi)=0.000;F②-③組內(nèi)=3.393,P②-③組內(nèi)=0.001;F③-④組內(nèi)=5.445,P③-④組內(nèi)=0.000；F④-⑤組內(nèi)=5.673,P④-⑤組內(nèi)=0.000；與術前相比：1)P<0.05；與術后第1周相比：2)P<0.05

表3 4組TNFR mRNA及蛋白表達比較

1)與C組相比；2)與L組相比；3)與M組相比:均P<0.05

圖1 4組TNFR1蛋白印跡

2.3沙利度胺劑量濃度與TNFR1 mRNA相對表達水平的相關性 隨著沙利度胺濃度的增加，組織細胞中mRNA相對表達水平不斷下降，二者呈明顯負相關(r=-0.497，P=0.036)，見圖2。

圖2 沙利度胺濃度與TNFR1 mRNA相對表達水平的相關性

3 討 論

目前，臨床治療NP的首要原則是緩解患者疼痛，而傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痛藥卻難以達到理想效果，阿片類藥物雖效果明確，但其不良反應嚴重，無法成為一線藥物〔12〕，而非甾體抗炎藥只對部分患者有效，其安全性尚未得到證實〔13〕?，F(xiàn)今較為深入研究的細胞機制有傷害性疼痛傳導通路及其相關的基因、蛋白、細胞因子等，其中，促炎細胞因子TNF因在傷害性傳導通路中起關鍵作用備受關注〔14,15〕。而TNF的最終作用效應由其受體水平?jīng)Q定〔16〕，因此，TNFR表達水平與NP存在密切關系。

沙利度胺是臨床常見的鎮(zhèn)靜藥，具有鎮(zhèn)靜、止癢、抗炎、抑制血管生成的功能〔17,18〕。Moreira 等〔19〕在所研究的動物模型中提出沙利度胺的鎮(zhèn)靜機制極可能是通過下調(diào)TNFR水平實現(xiàn)的。機械性痛閾與熱痛閾是大鼠CCI模型中常見的測量指標〔20,21〕，其測量值能較好地反映大鼠疼痛程度，間接反映藥物的鎮(zhèn)痛效果。本研究提示沙利度胺的鎮(zhèn)痛效應極可能與其劑量相關，劑量高，鎮(zhèn)靜效果相對較好。

TNFR包括TNFR1、TNFR2兩大類，兩者介導不同的信號傳導途徑，其中，TNFR1可表達于所有類型的細胞上，與TNF結合發(fā)揮生物活性；而TNFR2的功能與結構尚未得到深入剖析。本實驗提示沙利度胺可能具有下調(diào)TNFR1表達水平的功能，且TNFR1表達水平受沙利度胺劑量的影響，這極可能與沙利度胺對大鼠NP模型的鎮(zhèn)痛機制相關。TNFR2并不作用于傷害信號轉導通路，對TNF的生物活性無明顯影響。本文提示不同劑量的沙利度胺可能影響TNFR1 mRNA的表達，隨著沙利度胺劑量的升高，抑制TNFR1 mRNA水平的效果越明顯。

本實驗尚有不足之處，研究劑量過少，大鼠NP模型單一；同時，傷害傳導通路涉及基因、細胞因子較多，沙利度胺是否完全通過下調(diào)TNFR mRNA及蛋白對NP大鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果尚未可知，是否存在其他影響因子尚不明確。日后的實驗中將細分沙利度胺濃度、納入更多大鼠NP模型，進一步研究沙利度胺對NP大鼠模型的影響及作用機制。

綜上，沙利度胺可能通過影響TNFR1表達對大鼠CCI模型產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應，且其劑量與TNFR1表達水平可能相關，有望作為神經(jīng)病理性疼痛的治療靶點之一，具有潛在臨床治療價值。