時間治療學在大鼠坐骨神經擠壓傷電磁場治療中的應用

康 樂，韓 怡，朱 澍，王曉東，陳 臣，吳 寧，張 琦，革 軍

周圍神經損傷是骨科常見疾病之一，主要繼發(fā)于外傷、不當用力及手術等各類外力的直接及間接作用，愈合緩慢，預后效果不確定，治療頗為棘手。近年來人們嘗試采用電刺激、神經營養(yǎng)因子介入、神經生物支架等新方法，取得了一定成效[1-3]。本課題組前期將時間治療學的概念引入坐骨神經長節(jié)段缺損大鼠的神經支架復合電磁場治療中，效果良好[4]。但在實驗中存在神經支架材料和時間治療學兩種正性干預因素，且神經支架本身對于個體間神經修復存在諸多不確定性，因此時間治療學的單一作用究竟如何，還不得而知。本實驗去除神經支架這一干預因素，僅探討時間治療學在大鼠坐骨神經擠壓傷電磁場治療中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料

36只成年SD雌性大鼠購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK[軍] 2012-0007，體重240～250 g，符合動物倫理委員會規(guī)定。戊二醛、戊巴比妥、四氧化鋨、甲苯胺藍購自美國Sigma公司，電磁場裝置為自制[4]。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 采用隨機成組設計，將大鼠按隨機數字表法分為日間治療組、夜間治療組和空白對照組（僅建立模型不進行電磁場治療），每組12只，分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 坐骨神經擠壓傷模型建立 采用1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，側臥位切開大鼠左下肢外側皮膚，鈍性分離筋膜和肌肉，暴露左側坐骨神經。剝除神經纖維膜，充分松解神經，在梨狀肌下緣約0.5 cm處以有齒鑷全齒夾坐骨神經，夾閉3次，10 s/次，擠壓寬度約為5 mm。于夾痕上5 mm處神經外膜進行縫線標記。消毒并縫合傷口，常規(guī)飼養(yǎng)，1周后進行后續(xù)試驗。

1.2.3 電磁場治療 將日間治療組大鼠于上午9：00—11：00置于自制電磁場發(fā)生裝置中治療。電磁場相關參數：脈沖寬度0.2 ms、間隔0.05 ms，脈沖上升及下降時間分別為0.3 μs和2.0 μs，磁場強度9.6 Gs。將夜間治療組大鼠于21：00—23：00置于相同電磁場環(huán)境中。治療組動物每天治療1次，每次2 h，連續(xù)治療，治療時使用自然光線（即光源均來自采光窗，不使用人工光源），現場環(huán)境保持安靜干燥；空白對照組正常飼養(yǎng)，不予電磁場治療。

1.3 檢測指標

1.3.1 坐骨神經功能指數（sciatic functional index，SFI）測量 治療后8、12周時各組隨機選取6只大鼠檢測并記錄其SFI。具體方法為：實驗前訓練每只大鼠從收集通道的一端走向另外一端，行走過程保證大鼠順利通過。訓練完成后，在通道下方鋪設長100 cm、寬10 cm的記錄紙，于術足部位涂抹紅色染料，令大鼠再次通過通道，通道底部的記錄紙則印有大鼠足跡。將這些完整的足印掃描后測量以下各值：第3足趾尖到足跟的距離PL，第1、5趾間距離TS，第2、4趾間距離IT。利用以下公式計算：SFI=(-38.3×[EPL+NPL] /NPL)+(109.5×[ETS×NTS] /NTS)+(13.3×[EIT×NIT] /NIT)×8.8[2,4]，其中E前綴代表術側、N前綴代表非術側。數值越接近于0，說明其運動功能恢復越好；數值越接近于-100，其運動功能喪失程度越高。

1.3.2 坐骨神經透射電鏡檢查 各組大鼠于治療8、12周時分別隨機選取6只進行標本采集。按照神經縫線標記處前后2.5 mm取坐骨神經標本段（約5 mm），戊二醛固定24 h后繼續(xù)以1%四氧化鋨固定2 h。修剪神經成塊后選擇夾閉部位進行樹脂包埋，制作坐骨神經橫切面超薄切片，根據神經透射電鏡圖像計算神經元（有髓神經）數量、再生神經面積，記錄有髓神經直徑。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

如表1所示，電磁場治療8、12周，日間治療組SFI均顯著優(yōu)于夜間治療組及空白對照組。日間治療組大鼠神經元數量、再生神經面積、有髓神經直徑均明顯大于夜間治療組，而空白對照組各指標均明顯小于治療組（P＜0.05），透射電鏡圖片見圖1。

3 討論

3.1 周圍神經損傷的治療現狀

對于較為嚴重的周圍神經損傷，目前臨床上沒有特別有效的治療方法，通常以自體神經移植作為神經修復手術的“金標準”，但存在神經供體有限、移植術后供區(qū)感覺異常等問題。近年來隨著神經損傷修復新技術的不斷涌現，電磁場治療受到高度關注[5]。目前該方法主要用于骨折、骨關節(jié)炎、股骨頭壞死等的輔助治療[6-9]，對于神經損傷亦有很好的治療效果，安全無創(chuàng)，操作簡便。其作用機制可能與刺激雪旺氏細胞增殖，利于無髓軸索再生，進而促進周圍神經再生有關[10]。

3.2 時間治療學的作用機制及應用

在現代醫(yī)學中，時間治療學主要用于心血管疾病、皮膚病等疾病的治療，效果滿意[11-13]，而在中樞及周圍神經損傷領域，時間治療學方法目前主要用于減輕中樞系統(tǒng)病變產生的精神癥狀[14-15]。

眾所周知，隨著瓦勒氏變性進程的推進，周圍神經損傷后其自身的免疫環(huán)境將發(fā)生改變，進而對局部炎性因子及神經營養(yǎng)因子的分泌造成影響[16]。當晝夜節(jié)律變化時，機體內微環(huán)境可能發(fā)生相應改變，損傷神經的局部神經因子水平、血管化程度隨之發(fā)生變化，并對神經再生進程產生影響。因此，遵從時間治療學規(guī)律并按照合理的時間治療學方案施治，有望促進機體健康，提高常規(guī)治療的效果。

表1 各組大鼠治療后各時間點SFI及透射電鏡結果比較（±s，n=6）

表1 各組大鼠治療后各時間點SFI及透射電鏡結果比較（±s，n=6）

注：SFI：坐骨神經功能指數

日間治療組夜間治療組空白對照組F值P值SFI 8周-60.3±4.8-75.3±7.3-82.1±5.2 12.642 0.001 12周-42.7±5.8-55.2±3.2-61.6±2.2 13.816 0.001神經元數量/×103 8周7.67±0.36 5.41±0.67 3.17±0.51 150.000 0.000 12周10.43±0.29 8.14±0.13 4.12±0.33 1 338.301 0.000再生神經面積/mm2 8周0.89±0.11 0.73±0.03 0.52±0.12 31.216 0.000 12周1.30±0.37 0.91±0.18 0.71±0.08 32.810 0.000有髓神經直徑/μm 8周3.17±0.13 3.02±0.24 2.71±0.27 24.039 0.000 12周6.77±0.45 5.14±0.61 4.17±0.51 60.355 0.000

前期研究中我們將時間治療學用于大鼠長節(jié)段坐骨神經缺損的電磁場治療中，結果表明，按大鼠生物學時間節(jié)律制定治療方案，可以明顯提高神經再生效率，促進神經對靶器官的再支配[4]。分析其作用機制，可能是由于電磁場與生物節(jié)律共同影響機體的神經和體液調節(jié)，尤其是促進各類神經生長因子的分泌，從而加速了神經再生進程。本實驗中我們也看到，日間治療組的治療效果要明顯優(yōu)于夜間治療組，有力證實了時間治療學在電磁場坐骨神經修復中的應用價值。

圖1 各組坐骨神經透射電鏡掃描圖片（2 000×，Bar=10 μm）1A～1C 治療8周 1D～1F治療12周

3.3 治療時間點的選擇

21:00—23 :00大鼠開始進入夜間活動的興奮期，其生理狀態(tài)與人類晨起白天時的狀態(tài)較為相似，各類激素分泌達到峰值。參考相關大鼠生物節(jié)律的文獻[17]，同時考慮目前臨床大多數手術和康復治療的時間（9:00—11:00），我們選擇21:00—23:00以及12 h后的9:00—11:00兩個時間段作為治療效應的觀察時間點。結果表明，大鼠在日間休息時坐骨神經修復效果更好，提示人類的神經修復可能需要在夜間完成。

然而，夜間治療產生的噪聲等負面因素是否大于時間治療學效應，目前不得而知；對于坐骨神經修復效果，僅通過神經電鏡表現進行評估尚嫌不足；時間治療學手段是否有助于提高神經再支配的準確性也有待進一步觀察；比較時間治療學效應下促進大鼠坐骨神經修復的主導因素（神經營養(yǎng)因子種類、大鼠本身生理習性、血管化等）與人類神經修復的異同，也將是我們下一步工作的重點。