中空纖維測定法在胃癌臨床前藥效研究中的應(yīng)用

白吉明 張勃 李建華

摘要：目的? 探討中空纖維測定法在胃癌臨床前藥效研究中的應(yīng)用。方法? 將胃癌細(xì)胞株SNU-16、 SNU-484、SNU-668分別通過中空纖維管移植于裸鼠的皮下和腹腔，隨后用標(biāo)準(zhǔn)的抗癌藥物紫杉醇制劑給予治療，將每個(gè)細(xì)胞株的中空纖維的活性與異種移植物的活性進(jìn)行比較。結(jié)果? 使用優(yōu)化的接種密度和時(shí)間表，紫杉醇治療在胃癌細(xì)胞株SNU-16和SNU-484有效，經(jīng)紫杉醇處理后的SNU-16和SNU-484胃癌細(xì)胞株減少大于50%，但在SNU-668無效。與中空纖維測定結(jié)果一致，胃癌細(xì)胞株SNU-16和SNU-484在異種移植模型中紫杉醇治療后也表現(xiàn)出腫瘤消退。結(jié)論? 本實(shí)驗(yàn)研究表明中空纖維測定法對于篩選具有抗胃癌活性的小分子物質(zhì)是有效的。

關(guān)鍵詞：中空纖維測定法;異種移植模型抗腫瘤試驗(yàn);胃癌

中圖分類號(hào)：R96? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.07.027

文章編號(hào)：1006-1959（2019）07-0093-04

Abstract：Objective? To investigate the application of hollow fiber assay in the study of preclinical efficacy of gastric cancer. Methods? Gastric cancer cell lines SNU-16， SNU-484 and SNU-668 were transplanted into the subcutaneous and peritoneal cavity of nude mice through hollow fiber tubes， respectively， and then treated with the standard anticancer drug paclitaxel. The hollow fibers of each cell line were treated. The activity was compared to the activity of the xenograft. Results? Using optimized seeding density and schedule， paclitaxel treatment was effective in gastric cancer cell lines SNU-16 and SNU-484， and the SNU-16 and SNU-484 gastric cancer cell lines treated with paclitaxel were reduced by more than 50%， but at SNU-668 invalid. Consistent with the results of hollow fiber assays， gastric cancer cell lines SNU-16 and SNU-484 also showed tumor regression after paclitaxel treatment in a xenograft model. Conclusion? This experimental study shows that the hollow fiber assay is effective for screening small molecules with anti-gastric cancer activity.

Key words：Hollow fiber assay;Xenograft model anti-tumor test;Gastric cancer

近年來人類癌細(xì)胞株的一些臨床前體外和體內(nèi)腫瘤模型被廣泛應(yīng)用于開發(fā)和評(píng)價(jià)新的抗癌藥物。但研究顯示體外腫瘤模型不能完全復(fù)制復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境以及藥物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，在體外篩選之后仍需進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)篩選[1]。中空纖維測定法，最初是由美國國家癌癥研究所（NCI）開發(fā)，以促進(jìn)藥物的篩選和開發(fā)，用于在異種移植之前對有機(jī)小分子的體內(nèi)活性特征進(jìn)行測試[2]。中空纖維測定法是基于對中空纖維滲透物質(zhì)的分子量<500 KD的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，然后將纖維植入小鼠的不同部位。植入體內(nèi)后，待測化合物按一定的時(shí)間間隔和劑量給藥，然后從小鼠體內(nèi)取出纖維，再對纖維內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析，即可初步獲得化合物的體內(nèi)活性數(shù)據(jù)[3]。本研究主要探討中空纖維測定法在胃癌細(xì)胞株模型中的應(yīng)用價(jià)值。

1材料和方法

1.1小鼠? 選擇7周齡的雌性裸小鼠Balb/C（nu/nu）和非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠18只，所有小鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。置于室溫環(huán)境（22～26℃），每6個(gè)小鼠一組，共三組，每組均給與12 h的光/暗循環(huán)。中空纖維測定法、異種移植測定法各6只，設(shè)為紫杉醇組，余6只小鼠設(shè)為對照組，在預(yù)定的時(shí)間將小鼠采取頸椎脫位法處死。

1.2細(xì)胞株? 人胃癌細(xì)胞株SNU-16、SNU-484和SNU-668從廣州吉妮歐生物科技有限公司購買。所有的癌細(xì)胞株均由含有10%胎牛血清的RPMI1640（韓國）培養(yǎng)基培養(yǎng)，選用單層培養(yǎng)，溫度保持在37℃，置于含5%CO2的濕潤環(huán)境。

1.3藥物? 抗腫瘤藥物紫杉醇（CAS號(hào)：33.069-62-4，規(guī)格：20 mg/瓶）購買自上海吉至生化科技有限公司;黃酮類抗腫瘤藥物（CAS號(hào)：146426-40-6 規(guī)格：10 mg）購買自廈門研科生物技術(shù)有限公司，將藥物溶于10%二甲基亞砜（DMSO）中，中空纖維測定法小鼠每天接受4次腹腔內(nèi)注射紫杉醇（30 mg/kg）或黃酮類抗腫瘤藥物（5 mg/kg）;異種移植物測定法小鼠每天接受5次腹腔內(nèi)注射紫杉醇（30 mg/kg）或黃酮類抗腫瘤藥物（5 mg/kg）。對照組的小鼠給予腹腔內(nèi)注射含10% DMSO的生理鹽水。EW7197是一個(gè)新的小分子有機(jī)化合物，口服劑量為40 mg/kg，采用灌胃法。中空纖維測定法4 次/d;異種移植物測定法5次/d。

1.4中空纖維測定法? 每個(gè)小鼠接受3個(gè)含聚偏二氟乙烯（PVDF）的中空纖維（上海摩速科學(xué)器材有限公司），分別置入皮下或腹腔。紫杉醇組給予3只小鼠;對照組給予3只小鼠。具體方法：將具有1.0 mm內(nèi)徑和截留分子量為500 KDa的中空纖維單獨(dú)沖洗后在70%乙醇的室溫下培養(yǎng)，至少放置72 h。將纖維用去離子水沖洗，高壓滅菌，再用含20%胎牛血清的RPMI 1640液進(jìn)行沖洗。細(xì)胞株用胰蛋白酶/乙二胺乙酸培養(yǎng)，通過離心沉淀，使其重新懸浮在條件培養(yǎng)基，并用含有20%胎牛血清的RPMI1640液稀釋10倍。將細(xì)胞懸浮液用20號(hào)針頭填充于纖維。每個(gè)纖維管沿其長軸每2 cm進(jìn)行夾閉后熱封閉。每個(gè)樣品需要培養(yǎng)24～72 h，具體時(shí)間主要取決于每個(gè)纖維中的細(xì)胞株在37℃，5%的CO2環(huán)境中的生長速度。最佳的細(xì)胞懸浮密度表示在試驗(yàn)期間纖維中的每個(gè)細(xì)胞株的生長的線性關(guān)系，見表1。

在異氟醚麻醉下將培養(yǎng)合格的含胃癌細(xì)胞株的纖維植入7～10周齡的雌性裸小鼠Balb/C（nu/nu），三個(gè)皮下纖維包含三個(gè)胃癌細(xì)胞株。在裸鼠的頸背部做皮膚切口，通過套管針將三個(gè)皮下纖維通過該切口植入。三個(gè)腹膜腔纖維含有三個(gè)胃癌細(xì)胞株，通過腹壁切口按頭尾方向插入相同小鼠的腹膜腔。腹壁切口用兩層縫合線進(jìn)行縫合。以植入第5天的纖維中的活細(xì)胞量來確定細(xì)胞株的生長潛力。同時(shí)準(zhǔn)備好立體對照纖維，在試驗(yàn)過程中將其培養(yǎng)在相同的介質(zhì)。

根據(jù)植入纖維后的細(xì)胞株的生長情況，在植入纖維后的3～4 d給予藥物處理，1 次/d，連續(xù)4 d，最后1次給藥后將小鼠處死。用MTT（3-[4，5-二甲基噻唑-2]-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）染料轉(zhuǎn)換法進(jìn)行測定，確定纖維中有活性的細(xì)胞數(shù)。試驗(yàn)組和對照組小鼠中空纖維活細(xì)胞數(shù)的變化代表待測試劑中空纖維的活性。

分別通過灌胃和腹腔注射給藥法用人胃癌細(xì)胞株SNU-16測試了兩種化合物EW7197和黃酮類抗腫瘤藥物，確定中空纖維的條件是否進(jìn)行了優(yōu)化。

1.5異種移植試驗(yàn)? 癌細(xì)胞株（每100 μl的無血清RPMI液中含有107個(gè)細(xì)胞）和等量的基質(zhì)膠（上海浩然生物技術(shù)有限公司）混合后注入NOD/SCID小鼠的皮下組織。形成腫瘤之后，將其分割成3 mm的組織切片，序貫植入更大數(shù)量的NOD/SCID小鼠的皮下組織，用于對藥品異種移植活性的檢測。腫瘤體積V=1/2×a×b2，其中a和b分別是腫塊的最長和最短直徑[5]（單位為mm）。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí)，將小鼠體內(nèi)類似大小的腫瘤用SPSS17.0軟件生成隨機(jī)數(shù)字進(jìn)行分期。之后均連續(xù)5 d給予相同劑量的處理，后續(xù)處理同中空纖維測定法。腫瘤對藥物的反應(yīng)通過治療組腫瘤的平均體積/對照組腫瘤的平均體積（T/C%）來進(jìn)行評(píng)價(jià)，如果腫瘤呈回歸模型，T/C%的值為測量日治療組腫瘤體積的中位數(shù)下降的百分?jǐn)?shù)是相對于基線體積的，在治療的最初7 d，T/C%的最小值用來量化每個(gè)細(xì)胞株中藥物的異種移植活性。由于纖維中的每個(gè)細(xì)胞株的增長潛力存在差異，因此需要確定適當(dāng)?shù)拿芏葋肀ＷC試驗(yàn)期間纖維的持續(xù)增長。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不成對資料采用雙尾Student's t檢驗(yàn)，中空纖維和異種移植活性間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1中空纖維和異種移植法對胃癌的測定結(jié)果? 在生理鹽水治療組的小鼠，第7天和第8天纖維中的活細(xì)胞數(shù)量比第5天顯著增加。圖1表示中空纖維和異種移植法對胃癌的測定結(jié)果。經(jīng)紫杉醇治療后，小鼠腹腔中空纖維內(nèi)的SNU-16和SNU-484與活細(xì)胞團(tuán)塊比較減少明顯大于50%。

2.2胃癌細(xì)胞株經(jīng)腹腔和皮下注射的中空纖維活性與異種移植活性比較? 所有的細(xì)胞株都很容易在NOD/SCID小鼠的皮下側(cè)面組織形成異種移植腫瘤。經(jīng)紫杉醇治療后，SNU-16和SNU-484細(xì)胞株未顯示出明顯的腫瘤消退，其陽性異種移植活性分別為-60%和-70%。表2顯示的是中空纖維測定法和異種移植測定的相關(guān)性，與腹腔中空纖維測定結(jié)果一致，經(jīng)紫杉醇治療后，SNU-16，SNU-484均表現(xiàn)出陽性的中空纖維活性，以及有效的腫瘤反應(yīng)。而SNU-668細(xì)胞株未表現(xiàn)出顯著地異種移植活性。在胃癌細(xì)胞株紫杉醇的異種移植活性與中空纖維活性顯示出良好的相關(guān)性（r=0.94，P=0.001），見圖2。

3討論

在常規(guī)的中空纖維篩查中，本研究使用的是12種標(biāo)準(zhǔn)的腫瘤細(xì)胞株[4]，代表6種不同的組織學(xué)類型，根據(jù)其相應(yīng)的異種移植的預(yù)期活性進(jìn)行選擇。這些細(xì)胞株包括NCI-H23和NCIH522（非小細(xì)胞肺癌）;MDA-MB-231和MDA-MB-435（乳腺癌）;SW-620和COLO 205（結(jié)腸癌）;LOX和UACC-62（黑色素瘤）;OVCAR-3和OVCAR-5（卵巢癌）;U251和SF-295（膠質(zhì)瘤）。這些細(xì)胞根據(jù)其在中空纖維中的生長潛力的不同，密度波動(dòng)在2×106～10×106/ml，將中空纖維插入小鼠的腹腔或皮下組織。在小鼠體內(nèi)注入試驗(yàn)化合物的其中一個(gè)劑量。本研究使用標(biāo)準(zhǔn)的抗癌劑進(jìn)行驗(yàn)證，與對照組比較，這些藥物在中空纖維的活性明顯增加。由于其廣泛的抗癌活性，紫杉醇作為陽性對照應(yīng)用于中空纖維測定[5]。與對照組比較，如果50%以上的縮小，則認(rèn)為試驗(yàn)化合物有效。在后續(xù)的異種移植試驗(yàn)顯示該化合物在中空纖維有明顯的活性。

研究顯示，與對照組比較，經(jīng)紫杉醇處理后的SNU-16和SNU-484胃癌細(xì)胞株減少大于50%。這些細(xì)胞形成裸鼠移植瘤模型，紫杉醇在這些細(xì)胞中的異種移植活性與中空纖維的活性表現(xiàn)出良好的相關(guān)性。簡單地說，SNU-16生長成為漂浮的細(xì)胞同時(shí)含有MYC基因的擴(kuò)增，SNU-484生長成為單層并且含有突變型的p53。

EW7197是另外一個(gè)小的有機(jī)化合物，和黃酮類抗腫瘤藥物一起用于對中空纖維測定法的校驗(yàn)[6]。EW7197是一種2-吡啶基取代的咪唑，是ALK5抑制劑，用于腫瘤轉(zhuǎn)移的靶向治療。由于EW7197可以抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，故在中空纖維中不會(huì)表現(xiàn)任何活性。與此相反，黃酮類抗腫瘤藥物[7]是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，靶向抑制腫瘤細(xì)胞增殖，由于其顯著的抗腫瘤活性，作為陽性對照應(yīng)用于中空纖維測定法。在生物學(xué)有效劑量內(nèi)，EW7197在SUN-16細(xì)胞株中并不表現(xiàn)任何中空纖維活性，也不表現(xiàn)出異種移植活性，而黃酮類抗腫瘤藥物在SUN-16細(xì)胞株則表現(xiàn)出顯著的中空纖維活性劑異種移植活性。這表明胃癌中空纖維法是實(shí)用且可行的。

本研究顯示優(yōu)化了的中空纖維測定可用于胃癌細(xì)胞株，中空纖維測定法可用于新型小分子化合物和紫杉醇療效的比較，與異種移植實(shí)驗(yàn)比較，中空纖維測定法節(jié)省時(shí)間和資源，同時(shí)還可預(yù)測待測小分子的異種移植活性。因此，中空纖維測定法可用于篩選與胃癌有關(guān)的小分子化合物。盡管胃癌是目前世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，但標(biāo)準(zhǔn)的中空纖維測定板并未包括該疾病。我們采用良好特征的胃癌細(xì)胞株為該實(shí)驗(yàn)建立了最佳的條件。中空纖維測定活性與異種移植物活性有較高的相關(guān)性，因此，中空纖維測定法可用于篩選與胃癌有關(guān)的小分子化合物。

參考文獻(xiàn)：

[1]石然，徐銘恩，周青青，等.基于細(xì)胞3D打印技術(shù)的體外腫瘤模型構(gòu)建研究[J].中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2015，34（5）：618-622.

[2]鄧晶晶，紀(jì)圣君，陳燁.應(yīng)用中空纖維測定法評(píng)價(jià)藤甲酰苷對人癌細(xì)胞生長的抑制作用[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2014，32（4）：266-269.

[3]趙敏，師霞.黃芪對急性呼吸窘迫綜合征大鼠模型肺組織中SP-A的影響[J].中國臨床研究，2013，5（8）：1-3.

[4]張映城，顏兵，施俊，等.胃癌細(xì)胞中CD44陽性細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特征[J].中國腫瘤生物治療雜志，2016，23（4）：492-497.

[5]戚欣，張琳，李靜.中空纖維法在昆明小鼠中應(yīng)用——一種體內(nèi)抗腫瘤藥物篩選技術(shù)[J].中國海洋藥物，2013，32（4）：29-34.

[6]Son JY，Park SY，Kim SJ，et al.EW-7197，A Novel ALK-5 Kinase Inhibitor，Potently Inhibits Breast to Lung Metastasis.Mol Cancer Ther，2014，13（7）1：1704-1716.

[7]王麗萍，王新春.黃酮類化合物的代謝研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（11）：234-237.

收稿日期：2019-1-19;修回日期：2019-2-13

編輯/肖婷婷