正交設(shè)計(jì)優(yōu)化磷酸川芎嗪-冰片脂質(zhì)體的制備工藝*

劉劍敏，唐靜宜，程 路，陳 凡

（湖北省武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430022）

天然活性成分川芎嗪（TMP）為常用腦血管疾病治療藥物[1-2]。目前，臨床常用川芎嗪普通制劑有片劑、膠囊劑和注射劑[3-4]。其口服制劑半衰期短（0．5～2 h）、生物利用度低（10%～30%）[5]，靜脈注射4～6 h可達(dá)血藥濃度要求，但給藥用藥不方便。與靜脈給藥相比，經(jīng)鼻給藥能迅速將藥物經(jīng)嗅球直接轉(zhuǎn)運(yùn)至大腦和脊髓，達(dá)到相同的生物利用度[6]。ILLUM[7]報(bào)道，鼻噴霧劑給藥能有效提高TMP在腦內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，這種非侵入性的高效方式對(duì)腦缺血損傷的療效顯著。脂質(zhì)體作為經(jīng)鼻給藥的載體具有天然優(yōu)勢，首先具有較強(qiáng)的生物黏附性，藥物可緩慢釋放，具有腦部靶向性[8-9]，另外還具有生物利用度高、刺激性小、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[10]。冰片常作為川芎的藥對(duì)組合用于治療心腦血管疾病，配伍冰片對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)明顯優(yōu)于單用[11-12]，具有明顯的腦靶向優(yōu)勢，也為缺血性腦損傷防治提供了可能。本研究中探討了磷酸川芎嗪（TMPP）與冰片（B）配伍脂質(zhì)體的制備方法，為該劑型藥物抗腦缺血損傷的應(yīng)用提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（島津貿(mào)易＜上海＞有限公司）；RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振榮科學(xué)儀器有限公司）；XSP-1C型粒徑測定儀（上海精密儀器廠）；W201D型數(shù)控恒溫水浴鍋（上海申順科技有限公司）；葡聚糖凝膠-G50（北京化學(xué)試劑公司）。

1．2 試藥

磷酸川芎嗪對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100845-201702，純度為99．2%）；冰片（四川青神康華制藥有限公司，批號(hào)為170314）；Triton-X100（進(jìn)口分裝，中國碧云天公司，批號(hào)為ST795）；磷酸川芎嗪原料（北京燕京制藥廠，批號(hào)為20170123，純度＞99%）；大豆磷脂（山海太偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20170307），膽固醇（北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)為20170402）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 TMPP-B脂質(zhì)體的制備

取一定比例的大豆磷脂和膽固醇，置圓底燒瓶，精密稱定，加入十八胺，以乙醇溶解，水浴減壓蒸發(fā)除去溶劑，得分布均勻的薄膜，加入一定濃度的硫酸銨溶液水化，超聲得空白脂質(zhì)體混懸液[13]。將空白脂質(zhì)體經(jīng)葡聚糖凝膠G-50微型柱（10 cm×1 cm）以pH=7．4磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行洗脫，收集洗脫后的空白脂質(zhì)體，加入固定比例的TMPP-B藥液，于水浴中孵化，即得TMPP-B脂質(zhì)體。

2．2 包封率測定

2．2．1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zobox C18柱（150 mm×4．6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（50∶50，V／V）；檢測波長：295 nm；流速：1 mL／min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。磷酸川芎嗪保留時(shí)間為7．5 min，色譜圖見圖1，空白脂質(zhì)體在此保留時(shí)間未出峰。

2．2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取TMPP適量，精密稱定，加入甲醇-水（50∶50）溶解，制備成質(zhì)量濃度為100 mg／L的貯備液，備用。

供試品溶液：取TMPP-B脂質(zhì)體適量，置離心管中，以15 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心30 min。分別取離心后的上清液和未離心脂質(zhì)體溶液各適量，后者加Triton-X100溶解，即得。

2．2．3 方法學(xué)考察

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：用50%甲醇將對(duì)照品貯備液稀釋成5．0，10．0，25．0，50．0，100．0 mg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20μL。以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C，mg／L）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=0．562 1C-0．481 8，r=0．999 3（n=5）。結(jié) 果 表 明，TMPP質(zhì)量濃度在5．0～100．0 mg／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為20．0 mg／L TMPP對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣6次，計(jì)算TMPP含量。結(jié)果的RSD為0．34%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：配制TMPP對(duì)照品溶液6份，分別按擬訂色譜條件進(jìn)行檢測，計(jì)算6份溶液中TMPP峰面積與稱樣質(zhì)量的比值。結(jié)果的RSD為0．58%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別精密吸取TMPP-B脂質(zhì)體0．5mL，以Triton-X100溶解并定容至50 mL，得供試品溶液。分別于0，1，2，3，5，8 h時(shí)依法進(jìn)樣測定。結(jié)果的RSD為1．26%（n=6），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取20．0 mg／L對(duì)照品溶液1，2，3 mL，加入空白脂質(zhì)體，以Triton-X100溶解并定容至20 mL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果TMPP的平均回收率為101．38%，RSD為1．09%（n=3）。

2．2．4 樣品含量測定

取2．2．2項(xiàng)下供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，按2．2．1項(xiàng)下條件測定TMPP含量，得到WT和WF，計(jì)算包封率（E，%）=（WT-WF）／WT×100%。

2．3 制備工藝優(yōu)化

根據(jù)前期單因素考察預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以磷脂-膽固醇質(zhì)量比（因素A）、TMPP-（磷脂＋膽固醇）質(zhì)量比（因素B）、水化時(shí)間（因素C）及（NH4）2SO4濃度（因素D）為考察因素，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。采用乙醇注入式（NH4）2SO4梯度法制備TMPP-B脂質(zhì)體，以包封率為考察指標(biāo)，分別對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析。結(jié)果見表1和表2。

由表1可知，這4項(xiàng)因素對(duì)TMPP-B包封率的影響程度為A＞D＞B＞C，且最佳工藝條件為A1B2C1D2，即磷脂-膽固醇（2∶1），（磷脂＋膽固醇）-TMPP（15∶1），水化時(shí)間為30 min，（NH4）2SO4質(zhì)量濃度為0．2μmol／L。由表2可知，因素A，B，D影響顯著。以最優(yōu)工藝制備3批TMPP-B脂質(zhì)體，計(jì)算得包封率為（73．14±0．71）%，該工藝穩(wěn)定可行。

表1 TMPP-B脂質(zhì)體制備L9（34）正交設(shè)計(jì)及直觀分析

表2 方差分析結(jié)果

2．4 其他評(píng)價(jià)指標(biāo)

TMPP-B脂質(zhì)體粒徑，以XSP-1C型粒徑測定儀進(jìn)行粒徑分布測定，粒徑分布在113～145 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為（136．10±6．30）nm，分布均勻；Zeta電位為（-35．70±3．60）mV。取最優(yōu)工藝制備3批TMPP-B脂質(zhì)體，置4℃冰箱，放置4周，未見分層、變色、沉淀和破乳等改變，表明該工藝質(zhì)量穩(wěn)定。

3 討論

3．1 脂質(zhì)體制備方法

常規(guī)的制備方法有被動(dòng)載藥法中的薄膜分散、注入法等，主動(dòng)載藥法中的pH梯度法、（NH4）2SO4梯度法等[9]。新型制備方法較多，如超臨界反相蒸發(fā)法、冷凍干燥法、溫度敏感脂質(zhì)體、配體靶向修飾脂質(zhì)體等[9]。常規(guī)制備方法雖存在脂質(zhì)體包封率較低、粒徑不均一、有機(jī)溶劑殘留等缺點(diǎn)，但由于對(duì)所需設(shè)備要求低、生產(chǎn)周期較短、具體方法簡單易行、所得產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定性良好等眾多優(yōu)勢而應(yīng)用廣泛。

TMPP水溶性良好，故選用改進(jìn)的乙醇注入式（NH4）2SO4梯度法，制備條件溫和，避免了高溫對(duì)磷脂的氧化，且有機(jī)溶劑殘留少，所得TMPP-B脂質(zhì)體包封率達(dá)（73．14±0．71）%，且載藥量適宜，穩(wěn)定性良好。在包封率測定方法的選擇上，預(yù)試驗(yàn)中對(duì)比分析了凝膠過濾法和離心法2種測定方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以15 000 r／min離心30 min分離游離TMPP和脂質(zhì)體，所得結(jié)果與凝膠過濾法無明顯差異，故本研究中選擇操作更方便快速的離心法進(jìn)行。

3．2 物料比例

TMPP-B脂質(zhì)體制備時(shí)，預(yù)試驗(yàn)考察了影響最終產(chǎn)品質(zhì)量的諸多因素，發(fā)現(xiàn)磷脂-膽固醇質(zhì)量比、TMPP-（磷脂＋膽固醇）質(zhì)量比、（NH4）2SO4濃度及水化時(shí)間為主要影響因素。磷脂與膽固醇合適比例對(duì)穩(wěn)定脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)和提高包封率起至關(guān)重要的作用，磷脂濃度增加，藥物包封率隨之提高。但磷脂用量過大會(huì)造成水化不完全，且易凝聚，不利于產(chǎn)品穩(wěn)定性。膽固醇比例過大會(huì)使脂質(zhì)體易破裂，造成藥物的滲漏；而過少又會(huì)增加脂質(zhì)體的膜流動(dòng)性。磷脂與膽固醇的比例控制在2～7比較好[14]。

3．3 研究價(jià)值

正交設(shè)計(jì)、直觀分析和方差分析結(jié)果顯示，以包封率為考察指標(biāo)，考察四因素不同水平對(duì)TMPP包封率的影響，結(jié)果表明，該制備工藝的脂質(zhì)體包封率高，分布均勻，形態(tài)好，質(zhì)量穩(wěn)定，該方法簡單、合理。

冰片可促進(jìn)川芎嗪在腦部的分布[11-12]，兩者聯(lián)用治療腦血管疾病更快速。隨著新劑型的開發(fā)，藥物生物利用度的提高，穿透血腦屏障實(shí)現(xiàn)腦靶向成為可能，為后期的腦缺血損失治療研究提供參考。