查爾酮衍生物在阿爾茨海默病治療和診斷中的研究進展

陳琳，王柯人，桑志培*

（1.杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 311100；2. 南陽師范學院化學與制藥工程學院，河南 南陽 473000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD），又稱早老性癡呆，是老年人群中致死率和發(fā)病率最高的疾病之一。目前全球有超過4 700萬癡呆癥患者，預計到2050年將達到驚人的1.315億，其中中國癡呆癥患者將達到3 000萬[1-2]。截至目前，美國FDA批準用于AD的臨床治療藥物主要包括膽堿酯酶抑制劑（卡巴拉汀、他克林、多奈哌齊和加蘭他敏）和N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體拮抗劑美金剛，長期臨床應用表明，上述藥物僅能在短時期內(nèi)局限性地改善患者癥狀，并不能有效阻止或逆轉(zhuǎn)病程[3]。AD病因復雜，涉及的關鍵靶點有25個[4]。目前單靶點藥物不能從根本上改變AD的進程，針對誘發(fā)AD的多個靶點、多個環(huán)節(jié)同時干預疾病的多靶點藥物，即“一藥多靶（one-drug-multiple-targets）”有望為AD治療帶來新的曙光[5]。

β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）級聯(lián)假說揭示了Aβ沉積是導致AD的重要原因，在病理狀態(tài)下Aβ通過高度β折疊形成不溶性纖維并產(chǎn)生沉積，從而發(fā)揮神經(jīng)毒性，進一步引起炎癥反應和氧化應激，并導致神經(jīng)遞質(zhì)的缺乏和認知障礙，最終導致AD并發(fā)。另外，研究表明：Aβ斑塊在腦內(nèi)的緩慢沉積是AD的重要病理特征之一，而尸檢在腦部發(fā)現(xiàn)Aβ斑塊也是AD確證的重要標準。因此，以Aβ斑塊作為靶點，開發(fā)與之具有高親和力的分子探針，并利用分子影像技術實現(xiàn)AD的早期無損傷診斷具有重要的臨床和現(xiàn)實意義[6]。

查爾酮的化學結構為1，3-二苯基-2-丙烯-1-酮（1）以其為母體的天然化合物多存在于甘草、紅花等植物中，是植物體內(nèi)合成黃酮和異黃酮的主要前體物質(zhì)[7]。由于其分子結構具有較大柔性，能與多種生物大分子相互作用，因而呈現(xiàn)出廣泛的生物活性[8]。本文對查爾酮衍生物在AD治療和診斷方面的研究進展作一綜述。

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1 阿爾茨海默病治療藥物

查爾酮具有多重藥理活性，其中抗炎、抗氧化、清除自由基和抑制Aβ聚集等活性對AD具有潛在的治療作用，科研工作者基于經(jīng)典藥物設計原理和多靶點藥物設計策略對查爾酮母體結構進行結構優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了一系列抗AD先導化合物。

1.1 乙酰膽堿酯酶抑制劑

Sheng等[9]設計并合成了一系列查爾酮衍生物作為潛在的乙酰膽堿酯酶（acetycholinesterase，AChE）抑制劑，測試結果顯示合成的查爾酮衍生物均為選擇性AChE抑制劑。構效關系表明：取代基位于A環(huán)的4位比3位顯示了更好的抑制活性；取代基對AChE的抑制活性也有一定的影響，其活性順序由大到小依次為吡咯、二乙胺、哌啶、N-乙基-甲基胺，其中化合物2是活性最強的高選擇性AChE抑制劑（IC50= 0.037 μmol ·L-1），為進一步開發(fā)抗AD藥物提供了重要線索。

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Liu等[10]設計合成了一系列新穎的胺烷基取代的F-查爾酮衍生物，F(xiàn)原子的位置及胺烷基顯著地影響了化合物對膽堿酯酶的抑制活性。構效關系研究表明：3-氟取代的查爾酮衍生物的抑制活性比2-氟取代或4-氟取代顯示了較低的AChE抑制活性，當胺烷基為二乙胺或二甲胺時，2-氟取代查爾酮顯示了最強的AChE抑制活性，當胺烷基為哌啶或吡咯時，4-氟取代查爾酮顯示了最強的抑制活性；另外，氟原子的位置對于膽堿酯酶的選擇性具有重要影響，4-氟取代的查爾酮衍生物對于AChE抑制具有更高的選擇性，其中化合物3顯示了最強的 AChE 抑制活性 [IC50= 0.21 μmol · L-1，選擇性指數(shù)（selectivity index，SI）為65]。酶動力學和分子對接研究表明：化合物3是一個混合型AChE抑制劑，能夠同時作用于AChE的催化活性部位（catalysis active site，CAS）和外周陰離子位點（peripheral anionic site，PAS），其可作為抗AD藥物研發(fā)的候選化合物。

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Belluti等[11]合成了一系列噢哢類查爾酮-O-氨基甲酸酯衍生物，研究結果表明含有7個亞甲基的化合物絕大部分顯示了納摩爾水平的AChE抑制活性，其中擁有3，4，5-三甲氧基苯基結構的化合物4的AChE抑制活性最強（IC50= 0.52 nmol · L-1），且對丁酰膽堿酯酶（butyrylcholine esterase，BuChE）也有良好的抑制活性（IC50= 136 nmol · L-1）。構效關系研究表明：當用α-或β-萘基、蒽基、苯基取代化合物4中的3，4，5-三甲氧基苯基時，AChE抑制活性則明顯降低，當取代為3，5-二氯苯基片段時，AChE抑制活性進一步減弱；當化合物4中呋喃環(huán)被環(huán)戊酮、吡喃酮和環(huán)己酮取代時，AChE抑制活性不同程度地降低。另外，化合物4能夠抑制AChE誘導的Aβ聚集，上述研究結果為尋找新型的抗AD藥物提供了重要支撐。

Rampa等[12]在化合物4的基礎上，通過呋喃環(huán)開環(huán)設計并合成了一系列氨基甲酸酯類化合物，生物活性測試結果表明碳鏈長度對AChE抑制活性有顯著的影響，當碳鏈長度為3 ～ 7時，目標化合物顯示了良好的 AChE 抑制活性，IC50達 0.81 ～ 1.80 nmol·L-1，然而，當碳鏈長度增加到10時，AChE抑制活性則顯著降低?；衔?的AChE抑制活性最強（IC50= 0.81 nmol · L-1），BuChE抑制活性也較強（IC50= 106 nmol · L-1）。另外，化合物5對Aβ誘導的神經(jīng)毒性還有一定的保護作用，同時能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應，為抗AD藥物研發(fā)提供了先導化合物。

Liu等[13]設計并合成了一系列含氮的查爾酮衍生物，體外生物活性測試的構效關系表明：查爾酮衍生物的胺烷基側(cè)鏈對AChE抑制活性有顯著的影響，其中化合物6的AChE抑制活性最強（IC50= 0.85 μmol · L-1），并且對BuChE具有最高的選擇性（SI = 35.79）。與化合物3相似，化合物6也是混合型AChE抑制劑，能夠同時作用于AChE的CAS和PAS部位，是AD治療的潛在的先導化合物。

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Wang等[14]設計并合成了一系列新穎的查爾酮-卡巴拉汀衍生物。體外生物活性測試結果表明：查爾酮骨架上含有2個氨基甲酸酯（2′和4′位）時，對膽堿酯酶幾乎沒有抑制活性，當單氨基甲酸酯位于查爾酮3′位時對膽堿酯酶也幾乎沒有抑制活性，單氨基甲酸酯位于 1′、2′、5′和 6′時則為高選擇性的 BuChE 抑制劑。氨基甲酸酯片段中的取代基對膽堿酯酶抑制活性也有一定的影響，一般來說，N-乙基-N-甲基胺和二甲胺取代時顯示了較高的膽堿酯酶抑制活性，其中化合物7對AChE和BuChE均有顯著的抑制活性，其IC50分別為 0.87 和 0.36 μmol · L-1。另外，化合物 7 能夠降低SH-SY5Y細胞中氧化應激的產(chǎn)生?；衔?是一個潛在的先導化合物，其進一步的結構優(yōu)化仍在進行中。隨后，Xiao等[15]對查爾酮-卡巴拉汀衍生物中查爾酮的4′位進行結構改造，得到了一系列新穎的4′-氨基查爾酮-卡巴拉汀衍生物。研究結果表明：該類目標化合物為選擇性AChE抑制劑，且查爾酮母核的4′位被環(huán)胺取代比非環(huán)胺取代顯示了更強的抑制活性，其中4′位被吡咯環(huán)取代得到的化合物8的AChE抑制活性最強（IC50= 4.91 μmol · L-1），并對 BuChE具有很高的選擇性。酶動力學和分子對接結果表明化合物8是一個混合型AChE抑制劑，能夠同時結合AChE的CAS和PAS部位。另外，化合物8顯示了較強的抗氧化活性[氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC)為水溶性維生素E的2.83倍]和金屬離子絡合能力，并且能夠抑制自身誘導和Cu2+誘導的Aβ1-42聚集，其抑制率分別為89.5%和79.7%，同時化合物8還是一個高選擇性的單胺氧化酶（MAO）-B抑制劑（IC50=0.29 μmol · L-1）。因此，化合物8是一個潛在的抗AD先導化合物。

1.2 神經(jīng)保護劑

Kim等[16]設計并合成了一系列新穎的查爾酮衍生物，并測試了抗神經(jīng)退行性變化的保護作用，研究結果表明：化合物9在10 μmol · L-1濃度下顯示了最強的自由基清除能力，對Aβ誘導的神經(jīng)細胞損傷顯示了顯著的保護作用，對于Aβ1-42注射小鼠，體內(nèi)實驗表明化合物9在20和50 mg · kg-1時能夠提高學習和記憶能力對神經(jīng)退行性疾病是一個潛在的治療藥物。

1.3 單胺氧化酶B抑制劑

MAO是催化單胺類物質(zhì)氧化脫氨反應的酶，調(diào)節(jié)大腦和外周組織主要單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（如5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺和苯丙胺等）的濃度和新陳代謝其包括MAO-A和MAO-B，MAO-A主要位于神經(jīng)元軸突，MAO-B主要位于膠質(zhì)細胞。選擇性MAO-A抑制劑在臨床上用作抗抑郁和抗焦慮藥，抑制MAO-B可改善AD的癥狀[17-19]。選擇性的MAO-B抑制劑（如司來吉蘭和雷沙吉蘭）已經(jīng)證實能夠延緩AD的神經(jīng)變性[20]。因此，選擇性MAO-B抑制劑也是治療AD的重要策略。

Mathew等[21]合成了一系列甲氧基查爾酮，并測試了其對MAO-A和MAO-B的抑制活性，研究結果表明該系列化合物均是可逆的選擇性MAO-B抑制劑，其中化合物10的MAO-B抑制活性最強（IC50=0.22 μmol · L-1，SI = 0.05），分子對接進一步為其高活性提供了合理的解釋，化合物10作為可逆的選擇性MAO-B抑制劑，為進一步的抗AD藥物的結構優(yōu)化奠定了基礎。

Morales-Camilo等[22]合成并測定了查爾酮和噢哢類化合物的MAO抑制活性，研究結果表明化合物11顯示了最強的、高選擇性的MAO-B抑制活性（IC50= 2.8 μmol · L-1，SI＞35.7），其分子對接結果進一步證實了其良好的 MAO-B 抑制活性。

1.4 μ-鈣蛋白酶和組織蛋白酶B雙靶點抑制劑

μ-鈣蛋白酶（μ-calpain）是一種鈣依賴的半胱氨酸蛋白酶，能夠被體外微摩爾水平的鈣離子濃度激活，細胞內(nèi)鈣離子的紊亂導致了μ-鈣蛋白酶的高度活化，進一步通過β-分泌酶的高表達增加了Aβ的聚集和Tau蛋白磷酸化[23]。研究表明組織蛋白酶B（cathepsin B）在神經(jīng)炎癥的起始階段和神經(jīng)功能紊亂中起著關鍵作用[24]。因此，抑制μ-鈣蛋白酶和組織蛋白酶B是治療AD潛在的治療手段。

Jeon等[25]設計并合成了一系列查爾酮衍生物，通過測試目標化合物μ-鈣蛋白酶和組織蛋白酶B的抑制活性，發(fā)現(xiàn)化合物12對兩者顯示了較強的抑制活性，其 IC50分別為 18.83和 6.34 μmol · L-1。化合物 12在 5 μmol · L-1時能夠顯著地保護 H2O2誘導的 SH-SY5Y細胞損傷；此外，其還能減少Tau蛋白磷酸化和不可溶Aβ蛋白的形成。綜上所述，化合物12是μ-鈣蛋白酶和組織蛋白酶 B雙靶點抑制劑，對于AD治療是一個潛在的先導化合物。

1.5 多靶點抑制劑

Cao等[26]設計并合成了一系列4′-OH氟比洛芬-查爾酮衍生物作為抗AD潛在的多靶點抑制劑，體外生物活性測試結果表明：大部分目標化合物顯示了良好的多重活性，其中化合物13對自身誘導和Cu2+誘導的Aβ1-42聚集顯示了最強的抑制活性，其抑制率分別為78.2%和95.0%。此外，其還顯示了良好的抗氧化活性、MAO抑制活性、金屬離子螯合活性和抗炎活性。更進一步的研究表明該化合物能夠透過體外血腦屏障。綜上所述，化合物13是一個潛在的具有多靶點性質(zhì)的抗AD先導化合物，值得進一步開發(fā)。

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2 β淀粉樣蛋白熒光探針

Aβ斑塊的沉積是AD發(fā)展早期階段重要的病理特征，針對Aβ的生物標記物——熒光探針將能夠有效識別個人是否患AD，對AD早期診斷具有重要的臨床意義。

Ono等[27]合成了一系列新穎的查爾酮衍生物，Aβ聚集的體外結合試驗表明查爾酮衍生物對Aβ具有良好的結合能力，Ki為 2.9 ～ 104.7 nmol · L-1。通過給正常小鼠體內(nèi)注射放射性碘化的查爾酮衍生物來研究體內(nèi)分布情況，結果顯示放射性碘化的查爾酮衍生物在腦部有 很 好 的 吸 收 [第 2 min，2.0 ～ 4.7 %ID · g-1（%ID · g-1表示單位質(zhì)量組織的百分注射劑量）]，并且在腦部能夠快速地清除（第 30 min，0.2 ～ 0.6 %ID · g-1）。其中化合物14對Aβ1-42聚集顯示了最強的結合能力（Ki=2.9 nmol · L-1），其放射性碘化的化合物[125I]14在腦部具有良好的吸收（第2 min，2.04 %ID · g-1），并且在腦部具有良好的清除能力（第2 min，0.61 %ID · g-1）。以上結果提示放射性碘化的查爾酮衍生物對于AD的診斷可能是潛在的熒光探針。

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同時，Ono等[28]設計并合成了一系列噢哢衍生物作為檢測AD患者腦內(nèi)Aβ斑塊的熒光探針。體外Aβ聚集結合實驗表明目標化合物對Aβ聚集顯示了高親和力（Ki為 1.2 ～ 6.8 nmol · L-1），其中化合物 15 顯示了較好的親和力（Ki= 6.8 nmol · L-1），體內(nèi)分布結果表明化合物[125I]15在腦部顯示了良好的吸收能力（第2 min，1.89 %ID · g-1），并且能夠快速清除（第60 min，0.11%ID · g-1）。因此，噢哢衍生物[125I]15對于AD患者腦內(nèi)Aβ斑塊的檢測將是一個很有希望的探針。

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隨后，Ono等[29]設計并合成了一系列氟代-聚乙二醇（PEG）化的查爾酮用于AD患者Aβ斑塊的熒光檢測。體外研究結果表明：化合物對Aβ聚集的親和能力受4位氨基取代基的影響很大，二甲氨基、單甲氨基、氨基對Aβ聚集親和力依次降低；PEG的長度則對親和力影響不大，其中含有3個碳鏈長度的氟修飾的化合物16對Aβ聚集顯示了較強的親和力，其Ki為38.9 nmol ·L-1。小鼠體內(nèi)生物分布結果表明：[11C]16能夠透過血-腦脊液屏障，并且化合物16顯示良好的吸收性，其在第2 min的腦部吸收為4.31% ID · g-1，且表現(xiàn)了最快的放射性消除能力（第60 min，0.35 %ID · g-1）。另外，[18F]16在腦部也顯示了高的吸收能力和良好的清除能力。整體來說，氟代-PEG查爾酮衍生物16是一個很有希望的Aβ熒光探針。

Ono等[30]設計并合成了4個99mTc標記的查爾酮衍生物作為Aβ熒光探針。研究結果顯示該類衍生物對Aβ1-42聚集有更高的親和力；在正常小鼠體內(nèi)的分布實驗表明：化合物17在腦部顯示了最高的吸收能力（第2 min，1.48 %ID · g-1），側(cè)鏈胺烷氧基部分碳鏈增加則吸收降低，并且[99mTc]17的放射性在腦部能夠快速地清除（第60 min，0.17 %ID · g-1），增加碳鏈長度則清除能力降低，因此[99mTc]17是一個潛在的Aβ熒光探針

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Fuchigami等[31]報道了一系列放射性碘（125I）標記的查爾酮衍生物，用于開發(fā)針對Aβ斑塊的新型單光子發(fā)射計算機斷層成像術（single-photon emission computed tomography，SPECT）熒光探針。研究結果表明衍生物18和19對Aβ聚集顯示了高親和力，K分別為24.0和4.5 nmol · L-1。轉(zhuǎn)基因小鼠（Tg2576鼠）腦切片的熒光成像實驗表明化合物18和19能夠與Aβ斑塊特定地結合，體外放射自顯影法揭示了[125I]18在Tg2376鼠腦內(nèi)未觀察到Aβ聚集，然而，[125I]19在Tg2576鼠和AD患者腦內(nèi)觀察到了清晰的Aβ斑塊聚集。正常鼠的體內(nèi)分布結果表明：[125I]18表現(xiàn)了更好的藥動學性質(zhì)（第2 min，4.82 %ID · g-1；第60 min，0.45%ID · g-1），然而[125I]19只顯示了適當?shù)哪X部吸收（第2 min，1.62 %ID · g-1）并能夠緩慢地消除（第60 min，0.56%ID · g-1）。整體來說，[125I]19對于Aβ斑塊表現(xiàn)了更有前景的結合性質(zhì)，但需進一步通過結構修飾來提高血-腦脊液屏障透過性以及快速從腦部清除的能力。

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Cui等[32]設計并合成了一系列吲哚-查爾酮衍生物。構效關系表明：苯基對位是鹵素（Cl、Br或I）時能夠增加化合物對Aβ聚集的結合親和力；當用羥基取代鹵素時則親和力顯著降低，甲氧基取代則使親和力增強；苯環(huán)對位的氨基取代對親和力也有一定的影響，如二甲氨基取代衍生物和單氨基取代衍生物對Aβ聚集的結合親和力依次降低；增加芳香共軛體系也能夠增加親和力，其中含有吲哚苯基的查爾酮衍生物20對Aβ聚集表現(xiàn)了較好的親和能力（Ki= 8.22 nmol · L-1）。進一步的體內(nèi)生物分布實驗表明[125I]20在腦部具有較低的吸收性（第2 min，0.41 %ID · g-1）和緩慢的清除能力（第60 min，0.13 %ID · g-1），該研究為進一步優(yōu)化吲哚-查爾酮衍生物的結構以便尋找Aβ熒光探針提供了重要線索。

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3 結語

AD是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，是老年人群中發(fā)病率和致死率最高的疾病之一。目前已上市的單一靶點藥物只能短期內(nèi)暫時緩解AD的癥狀，并不能有效阻止或逆轉(zhuǎn)AD的進程。鑒于AD的復雜病因，多靶點藥物（multi-target-directed-ligands，MTDLs）被認為是最有效的治療策略。Aβ斑塊在腦內(nèi)的緩慢沉積是AD的重要病理特征之一，以Aβ斑塊為靶點，開發(fā)與之具有高親和力的分子探針，對AD早期診斷具有重要的臨床和現(xiàn)實意義；查爾酮具有重要的藥理作用，其衍生物作為多靶點抗AD藥物已經(jīng)取得了新的進展，但由于查爾酮骨架具有α，β-不飽和酮結構，易與體內(nèi)生物大分子發(fā)生結合，使得其作為AD治療藥物受到一定限制。靶向Aβ熒光探針的查爾酮衍生物作為AD早期診斷劑已獲得初步的成果，其作為熒光探針的研發(fā)將進一步激起科學家的興趣，值得AD領域深入開發(fā)。