4種硝基呋喃代謝物復(fù)合熒光免疫層析試紙條的制備

郭會(huì)燦

摘 要：為建立一種基于量子點(diǎn)熒光免疫層析技術(shù)快速檢測(cè)4 種硝基呋喃類代謝物的方法，采用N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC）法合成4 種硝基呋喃類代謝物的人工抗原，并融合制備對(duì)應(yīng)的單克隆抗體，通過(guò)EDC-NHS一步法將量子點(diǎn)微球（quantum dot submicrobeads，QBs）分別與3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone，AMOZ）、1-氨基-2-乙內(nèi)酰（1-aminohydantoin，AHD）和氨基脲（semicarbazid，SEM）偶聯(lián)，得到相應(yīng)的QBs探針，在此基礎(chǔ)上制備復(fù)合熒光免疫層析試紙條。結(jié)果表明：AOZ、AHD、SEM和AMOZ的檢出限分別為0.4、0.4、0.5、0.5 μg/L;通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)對(duì)批內(nèi)和批間的重復(fù)性和準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出該試紙條的批內(nèi)檢測(cè)回收率為80%～110%，批內(nèi)變異系數(shù)在15%以內(nèi)，批間回收率為80%～100%，批間變異系數(shù)在15%以內(nèi);且AOZ、AHD、SEM和AMOZ之間的交叉反應(yīng)率小于0.1%，說(shuō)明成功將熒光免疫層析技術(shù)和多元檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)4 種硝基呋喃類代謝物，且試紙條的靈敏度和準(zhǔn)確性高、特異性好。

關(guān)鍵詞：硝基呋喃代謝物;熒光免疫層析;免疫抗原;量子點(diǎn)微球

Abstract： This research was done in order to establish a rapid quantum dot （QD）-based immunochromatographic assay （ICA） for the simultaneous detection of four nitrofuran metabolites （3-amino-2-oxazolidinone （AOZ）， 5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone （AMOZ）， 1-aminohydantoin （AHD） and semicarbazid （SEM））. Immunogens were synthesized by N-hydroxysuccinimide （NHS）/ 1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride （EDC） method， and monoclonal antibodies were prepared by cell fusion. QD microspheres were coupled with AOZ， AHD， SEM and AMOZ， respectively by one-step method using EDC and NHS to obtain quantum dot submicrobeads （QBs） probes. On this basis， a fluorescent immunochromatographic strip was prepared. The results showed that the detection limits of this test strip for AOZ， AHD， SEM and AMOZ were 0.4， 0.4， 0.5 and 0.5 μg/L， respectively. The repeatability and accuracy within and between batches were evaluated by spiked recovery experiments， and the results showed that the recovery rates were 80%–110% and 80%–100% with coefficient of variations of less than 15% for intra- and inter-batch assays， respectively. The cross-reactivity among AOZ， AHD， SEM and AMOZ was less than 0.1%. In conclusion， the combination of fluorescent immunochromatography and multivariate detection technique can be successfully applied to simultaneously detect four nitrofuran metabolites with high sensitivity， accuracy and specificity.

Keywords： nitrofuran metabolites; fluorescent immunochromatography; immunogen; quantum dot microspheres

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190322-065

中圖分類號(hào)：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2019）04-0029-07

硝基呋喃類抗生素作為一類由人工合成、具有5-硝基特定結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌類藥物，被廣泛應(yīng)用在畜禽胃腸道疾病的治療[1]，或者作為飼料添加劑使用。硝基呋喃類抗生素主要包括呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃西林（Nitrofurazone）、呋喃它酮（Furaltadone）及呋喃妥因（Nitrofurantoin）等，此類藥物也是一類具有潛在致癌性和能夠誘導(dǎo)突變的物質(zhì)[2]。歐盟于1995年發(fā)布了一項(xiàng)關(guān)于禁止使用呋喃類抗菌物質(zhì)的指令，規(guī)定不得在動(dòng)物源性食品中檢出呋喃類物質(zhì)。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告[3]中列出的禁止使用藥物清單中包括呋喃它酮和呋喃唑酮，且規(guī)定在動(dòng)物性食品中不得檢出。硝基呋喃類藥物在機(jī)體內(nèi)代謝速度很快且半衰期短、僅持續(xù)數(shù)小時(shí)的特點(diǎn)，造成了檢測(cè)機(jī)體內(nèi)硝基呋喃類藥物相當(dāng)困難。呋喃唑酮的代謝物為3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ），呋喃它酮的代謝物為5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone，AMOZ），呋喃妥因的代謝物為1-氨基-2-乙內(nèi)酰（1-aminohydantoin，AHD），呋喃西林的代謝物為氨基脲（semicarbazid，SEM），以上代謝產(chǎn)物能夠與機(jī)體的組織蛋白質(zhì)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)合物，在機(jī)體內(nèi)殘留很長(zhǎng)時(shí)間，其代謝物則通過(guò)水解反應(yīng)從蛋白質(zhì)中游離出來(lái)。因此，硝基呋喃類藥物的真實(shí)殘留狀況由檢測(cè)得到的其代謝物的含量來(lái)體現(xiàn)。同時(shí)，檢測(cè)硝基呋喃類藥物的代謝產(chǎn)物對(duì)硝基呋喃類藥物的殘留起到監(jiān)控作用。目前，歐盟對(duì)硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)方法靈敏度做出了規(guī)定，要求檢測(cè)方法靈敏度為1 μg/kg。我國(guó)目前采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21311—2007《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》[4]，此方法的SEM、AOZ、AMOZ和AHD檢出限（limits of detection，LOD）均為0.5 μg/kg。

硝基呋喃類代謝物殘留的檢測(cè)方法多種多樣，儀器法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[5-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[7-9]、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography- mass spectrometry，LC-MS）法和分光光度法，免疫法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法[10-11]、免疫層析技術(shù)等。儀器法的優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化程度高、精確度高、假陽(yáng)性率低，缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴、成本高、操作繁瑣、樣品處理復(fù)雜、需要專業(yè)分析人員。ELISA法雖然具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、高特異性的特點(diǎn)，但其缺點(diǎn)是易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。近年來(lái)，免疫層析技術(shù)成為熱門檢測(cè)技術(shù)，主要包括以膠體金、熒光、磁珠為基礎(chǔ)的免疫層析技術(shù)，研究比較多的是膠體金免疫層析技術(shù)，以膠體金為示蹤物標(biāo)記抗原或抗體，用于半定量或定性檢測(cè)，此方法靈敏度不高，在針對(duì)心血管標(biāo)志物、腫標(biāo)等對(duì)靈敏度有高要求的領(lǐng)域受限。柳愛春等[12]研制的4 種硝基呋喃代謝物快速膠體金檢測(cè)試紙條的LOD分別為AOZ 0.5 μg/kg、SEM 1.0 μg/kg、AMOZ 1.0 μg/kg、AHD 2.0 μg/kg，肉眼觀察結(jié)果只能做到半定量檢測(cè)。免疫磁珠層析技術(shù)以磁性微球與抗原或抗體特異性結(jié)合，靠外界磁場(chǎng)產(chǎn)生定向移動(dòng)，通過(guò)檢測(cè)磁信號(hào)代替光信號(hào)，優(yōu)點(diǎn)是敏感性高，缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴、技術(shù)復(fù)雜、工藝實(shí)施難度高，目前尚無(wú)研究報(bào)道將此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用到硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)中。熒光免疫層析技術(shù)又分為量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）層析技術(shù)和上傳發(fā)光技術(shù)。上傳發(fā)光技術(shù)以鑭系元素?fù)诫s入陶瓷顆粒，構(gòu)成上轉(zhuǎn)化顆粒（upconversion particle，UCP），作為標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)免疫層析，優(yōu)點(diǎn)是安全、穩(wěn)定、靈敏，缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴、工藝要求高。袁建等[13]利用銪（Ⅲ）元素的納米粒子標(biāo)記抗體建立快速檢測(cè)4 種硝基呋喃代謝物的免疫層析法，此方法用肉眼觀察只能達(dá)到半定量檢測(cè)，4 種代謝物的LOD分別為CPSEM（CP（羧基苯甲醛）與SEM的衍生物））0.5 ng/g、CPAMOZ（CP與AMOZ的衍生物））0.5 ng/g、CPAHD（CP與AHD的衍生物）0.1 ng/g、CPAOZ（CP與AOZ的衍生物）0.5 ng/g，同時(shí)該免疫層析法是試紙條和微量滴定孔組合的形式，在加樣時(shí)比較繁瑣，需要人工吸取4 種銪（Eu）納米球標(biāo)記抗體及待檢樣品，一起加入到微量滴定孔進(jìn)行反應(yīng)，很容易造成人為誤差，且操作繁瑣、重復(fù)性差。量子點(diǎn)熒光層析技術(shù)以主族Ⅱ～Ⅵ（如CdSe）、Ⅲ～Ⅴ（InAs、GaSe、InP）元素構(gòu)成熒光探針標(biāo)記物，通過(guò)能量躍遷可以發(fā)出多種不同顏色的光，很適合作為多組分檢測(cè)的標(biāo)記物，再加上準(zhǔn)確性好、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、成本低，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、獸藥等行業(yè)，成為熱門研究方向[14]。

本研究以量子點(diǎn)熒光免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ)，建立4 種硝基呋喃代謝物殘留的復(fù)合熒光免疫分析技術(shù)，通過(guò)性能測(cè)試對(duì)試紙條進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，對(duì)該多元熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)在獸藥殘留領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BALB/c小鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)。

AOZ、AMOZ、1-氨基-乙內(nèi)酰脲鹽酸鹽（1-aminohydantoin hydrochloride，AHD·HCl）、鹽酸氨基脲（semicarbazide hydrochloride，SEM·HCl）（純度≥99.0%）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國(guó)Sigma公司;量子點(diǎn)熒光微球

美國(guó)Ocean NanoTech公司;N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、無(wú)水甲醇? ?天津永大化學(xué)試劑有限公司;鄰醛基苯甲酸（2-carboxybenzaldehyde，2-CBA）、對(duì)醛基苯甲酸（4-carboxybenzaldehyde，4-CBA） 阿拉丁試劑（上海）有限公司;N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 南京化學(xué)試劑股份有限公司;1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC） 上海思域化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RF-6000熒光分光光度計(jì) 日本島津公司、NanoDrop 2000紫外掃描儀、Micro17超速離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;CR-GIII高速離心機(jī) 日本Hitachi公司;MiLLi-QingegraLLo超純水系統(tǒng) 德國(guó)密理博公司;JA3003電子精密天平 上海衡平儀器儀表廠;T-Meter I熒光免疫分析儀 河北特溫特生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫抗原的制備

半抗原的合成[15]：以CPAOZ為例，合成半抗原。將0.4 g 4-CBA用2 mL純水溶解，緩緩加DMF至上述溶液，邊滴加邊攪拌，直至4-CBA完全溶解;稱取0.5 g AOZ緩慢傾入上述反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)5 h，3 000 r/min離心，保留沉淀?xiàng)壣锨逡?，沉淀為淡黃色，再加入0.01 mol/L?PBS重懸沉淀，洗滌3 次，50 ℃烘干，得半抗原CPAOZ。同理，用AMOZ、AHD·HCl和SEM·HCl置換上述步驟中的AOZ，即可得到半抗原CPAMOZ、CPAHD和CPSEM。

免疫抗原的合成[16]：稱取24 mg的CPAOZ，用2 mL DMF溶解，緩慢加入溶有18 mg NHS的PBS緩沖液，充分?jǐn)嚢?，反?yīng)5 min;緩慢加入溶有40 mg EDC的PBS緩沖液，室溫?cái)嚢? h;稱取60 mg BSA溶于2 mL PBS中，然后將上述反應(yīng)溶液緩慢加入，4 ℃攪拌反應(yīng)過(guò)夜;0.01 mol/L PBS透析3 d，-20 ℃保存?zhèn)溆?。AOZ抗原合成路線圖如圖1所示。檢測(cè)原同法制備。

1.3.2 量子點(diǎn)熒光微球（quantum dot submicrobeads，QBs）標(biāo)記抗體

采用EDC-NHS一步法[17]將QBs分別與4 種硝基呋喃類代謝物偶聯(lián)[18]：將1 mg QBs用5 mL磷酸（PB）緩沖液（含0.5% 吐溫-20、0.01 mol/L、pH值為6.0）進(jìn)行懸浮，10 000 r/min離心30 min，收集沉淀;沉淀用5 mL PB緩沖液溶解后，加入1.0 μg EDC和0.8 μg NHS，混勻后避光反應(yīng)1 h，將100 μg抗體加入到混合液中，混合攪拌3 h，再加入0.1 mL 0.3 mol/L的甘氨酸封閉2 h，10 000 r/min離心30 min，收集沉淀;沉淀用750 μL復(fù)溶液（含5%蔗糖、5% BSA、2% 吐溫-20和1% ProClin的PB緩沖液）復(fù)溶，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 QBs標(biāo)記抗體偶聯(lián)物的表征

通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)定QBs（8 pmol/L）[19]，光電倍增管電壓為700 V，響應(yīng)時(shí)間為0.5 s，激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm，發(fā)射起始波長(zhǎng)為500～650 nm，發(fā)射狹縫與激發(fā)狹縫均為5 nm，掃描速率為240 nm/min。

1.3.4 偶聯(lián)pH值的優(yōu)化

在1.3.2節(jié)QBs標(biāo)記抗體過(guò)程中，分別選用pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的0.01 mol/L PB緩沖液[20]。用標(biāo)記好的抗體測(cè)試試紙條，檢測(cè)不同標(biāo)記pH值條件下的熒光強(qiáng)度變化，每個(gè)pH值重復(fù)檢測(cè)5 次，確定最佳標(biāo)記pH值。

1.3.5 飽和標(biāo)記量的優(yōu)化

在1.3.2節(jié)QBs標(biāo)記抗體過(guò)程中，保持QBs的量不變，分別加入25、50、100、125、150、200、300 μg的抗體進(jìn)行偶聯(lián)，測(cè)定方法同1.3.4節(jié)，結(jié)果采用Sigmaplot軟件繪制曲線圖，橫坐標(biāo)為抗體飽和標(biāo)記量，縱坐標(biāo)為T線熒光強(qiáng)度，確定最佳飽和標(biāo)記量。

1.3.6 試紙條的組成

QBs熒光免疫層析試紙條的組成如圖2所示，其中QBs探針包被在結(jié)合墊上[21-22]，AOZ抗原、AMOZ抗原、AHD抗原和SEM抗原分別作為T線，羊抗兔二抗作為C線，依次噴涂在NC膜上。

1.3.7 樣品預(yù)處理

1）衍生[23]：稱取5.0 g魚肉樣品，加入10 mL HCl溶液（1 mol/L），進(jìn)行均質(zhì)處理后放入50 mL離心管中，加入500 μL鄰硝基苯甲醛溶液（30 mmol/L），50 ℃混勻反應(yīng)60 min;

2）萃取[24]：將上述反應(yīng)溶液用1 mol/L的NaOH調(diào)至pH 7.0，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋萃取1 min，8 000 r/min離心20 min，留取乙酸乙酯層，60 ℃氮?dú)獯蹈?用1 mL正己烷復(fù)溶，加入1 mL 0.1 mol/L的PBS緩沖液進(jìn)行萃取，8 000 r/min離心20 min，留取緩沖液層用于檢測(cè)。

1.3.8 試紙條性能測(cè)試

1.3.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及檢測(cè)限測(cè)定

分別制備4 種硝基呋喃代謝物的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以AOZ為例，將1 mg/mL的AOZ母液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度分別為0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/L），進(jìn)行QBs熒光免疫層析試紙條測(cè)試，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定5 個(gè)平行，用干式熒光分析儀進(jìn)行檢測(cè)，并讀取數(shù)值。設(shè)定質(zhì)量濃度為0 μg/L時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)溶液FIT/FIC比值為B0，其他加標(biāo)質(zhì)量濃度的FIT/FIC比值為B，以B/B0×100為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，確定定量范圍、抑制率半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）及檢測(cè)限IC10[25]。

1.3.8.2 準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)

通過(guò)魚肉樣本添加回收實(shí)驗(yàn)檢測(cè)QBs熒光免疫層析試紙條的準(zhǔn)確度和精密度[26-28]，在空白魚肉組織中添加0.5、2.0、4.0 μg/L 3 個(gè)質(zhì)量濃度的4 種硝基呋喃代謝物，按照1.3.7節(jié)的方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定5 次，共測(cè)定3 個(gè)批次，計(jì)算加標(biāo)回收率、批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)。

1.3.8.3 特異性實(shí)驗(yàn)

分別測(cè)試其中1 種硝基呋喃代謝物與其他3 種代謝物的交叉反應(yīng)性，將4 種硝基呋喃代謝物分別配制成0.5、10.0、100.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用熒光免疫層析試紙條進(jìn)行測(cè)試，用干式熒光分析儀進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.3.8.4 與LC-MS/MS法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證本研究中量子點(diǎn)復(fù)合熒光免疫層析試紙條在魚肉樣本檢測(cè)中的可用性，對(duì)來(lái)自石家莊市獸藥監(jiān)察所的5 份已知樣品分別用自制試紙條和GB/T 21311—2007中描述的LC-MS/MS法（樣品前處理和檢測(cè)方法）進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin制圖軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工合成抗原的紫外掃描鑒定結(jié)果

由圖3可知，BSA的最大吸收峰在280 nm波長(zhǎng)處，CPAOZ的最大吸收峰在330 nm波長(zhǎng)處，BSA和CPAOZ偶聯(lián)后，在波長(zhǎng)280 nm和330 nm處均疊加出現(xiàn)吸收峰，表明偶聯(lián)成功。根據(jù)朗伯-比爾定律，計(jì)算出CPAOZ-BSA的分子結(jié)合比為15∶1。同理，CPSEM-BSA、CPAHD-BSA和CPAMOZ-BSA的紫外掃描圖如圖4～6所示，均表明偶聯(lián)成功，CPSEM-BSA分子結(jié)合比為13.5∶1、CPAHD-BSA分子結(jié)合比為19.7∶1、CPAMOZ-BSA分子結(jié)合比為19.6∶1。

2.2 偶聯(lián)pH值的確定

pH值會(huì)影響偶聯(lián)過(guò)程中抗體的生物活性，通過(guò)評(píng)價(jià)pH值對(duì)熒光免疫層析試紙條檢測(cè)FIT、FIC、FIT/FIC值和競(jìng)爭(zhēng)抑制率的影響，確定最佳偶聯(lián)pH值[29]。由圖7可知，pH值對(duì)熒光免疫層析試紙條的FIT/FIC值影響不大，但是對(duì)FIT、FIC和競(jìng)爭(zhēng)抑制率有較大影響。當(dāng)pH值為6.5時(shí)，試紙條C線、T線熒光強(qiáng)度最高，且競(jìng)爭(zhēng)抑制率最好，達(dá)69%。因此，選擇pH值為6.5的緩沖液作為偶聯(lián)緩沖液。

2.3 飽和標(biāo)記量的確定

將1 mg QBs與不同量的抗體進(jìn)行偶聯(lián)，檢測(cè)陰性樣本試紙條T線的熒光強(qiáng)度變化[30]。由圖8可知，T線的熒光強(qiáng)度隨抗體飽和標(biāo)記量的增加而增強(qiáng)，在100 μg時(shí)強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。因此確定100 μg/mg是最佳抗體飽和標(biāo)記量。

2.4 熒光免疫層析試紙條的性能測(cè)試

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

為了減少基質(zhì)效應(yīng)，本研究采用魚肉組織陰性樣本添加系列標(biāo)準(zhǔn)品，繪制QBs熒光免疫層析試紙條定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到CPAOZ的線性范圍為0.1～5.0 μg/L，線性方程為y=1.783 1x+2.115 1（R?=0.997 7），IC50為1.54 μg/L，IC10為0.4 μg/L;CPAHD的線性范圍為0.1～5.0 μg/L，線性方程為y=1.675 0x+1.968 8（R2=0.994 7），IC50為1.4 μg/L，IC10為0.4 μg/L;CPSEM的線性范圍為0.1～5.0 μg/L，線性方程為y=1.906 6x+2.323 6（R?=0.996 1），IC50為1.75 μg/L，IC10為0.5 μg/L;CPAMOZ的線性范圍為0.1～5.0 μg/L，線性方程為y=1.995 9x+2.442 1（R?=0.998 0），IC50為1.87 μg/L，IC10為0.5 μg/L。通過(guò)計(jì)算IC10得出的AOZ、AHD、SEM和AMOZ的方法檢出限分別為0.4、0.4、0.5、0.5 μg/L。

2.4.2 準(zhǔn)確度及精密度

通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)對(duì)批內(nèi)和批間重復(fù)性和準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)價(jià)。由表1可知，該QBs熒光免疫層析試紙條的批內(nèi)檢測(cè)回收率為80%～110%，批內(nèi)變異系數(shù)在15%以內(nèi)，批間回收率為80%～100%，批間變異系數(shù)在15%以內(nèi)，表明該試紙條具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，符合《食品中獸藥殘留檢測(cè)指南》規(guī)定的獸藥殘留檢測(cè)方法的回收率為80%～120%、變異系數(shù)在15%以內(nèi)的要求。

2.4.3 特異性

用QBs熒光免疫層析試紙條分別測(cè)試4 種代謝物的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果表明，某1 種硝基呋喃代謝物對(duì)其他代謝物的測(cè)試未出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，4 種硝基呋喃代謝物AOZ、AHD、SEM和AMOZ之間的交叉反應(yīng)率小于0.1%，表明試紙條具有較好的特異性[31-32]。

2.4.4 與LC-MS/MS法的比較結(jié)果

為驗(yàn)證試紙條能夠滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的要求，將其與GB/T 21311—2007中描述的LC-MS/MS儀器法進(jìn)行對(duì)比。由表2可知，QBs熒光免疫層析試紙條與LC-MS/MS法的檢測(cè)結(jié)果有很好的相關(guān)性，2 種方法均檢出2 份陰性樣本，分別為樣品1和樣品5，檢出3 份陽(yáng)性樣本，分別為樣品2～4，2 次重復(fù)測(cè)定結(jié)果一致。上述結(jié)果證明，自制的QBs熒光免疫層析試紙條可以滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。

3 討 論

免疫層析技術(shù)由于其檢測(cè)周期短、成本低、配套儀器簡(jiǎn)單，已經(jīng)在食品安全、獸藥殘留、生物醫(yī)藥等行業(yè)廣泛應(yīng)用，但其檢測(cè)靈敏度相對(duì)于儀器法（電化學(xué)傳感、色譜技術(shù)、微陣列技術(shù)）較低。目前，主要研究從以下幾個(gè)方面提高方法的靈敏度：1）選用高特異、高親和性的抗體，在處理過(guò)程中采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施，減少生物活性的損失，從而提高方法自身的檢測(cè)靈敏度;

2）改進(jìn)層析的方法，去掉結(jié)合墊，處理樣品墊，使其具有良好的穩(wěn)定性和釋放性，同時(shí)可以增加待檢樣本與標(biāo)記抗體在液相中的反應(yīng)時(shí)間，使反應(yīng)更充分，提高競(jìng)爭(zhēng)效率，從而提高方法的檢測(cè)靈敏度;3）選用新型可替代、超靈敏的標(biāo)記物，目前大眾所熟知的標(biāo)記物質(zhì)有膠體金顆粒、彩色乳膠微球，近年新發(fā)展起來(lái)的量子點(diǎn)、量子點(diǎn)微球，由于其獨(dú)特的光學(xué)特性及高強(qiáng)度的發(fā)射光譜特性，逐漸作為新標(biāo)記物被應(yīng)用。QBs是將量子點(diǎn)熒光染料通過(guò)包埋或吸附的方式固定在高聚物載體上，在高聚物載體的殼結(jié)構(gòu)下性質(zhì)穩(wěn)定，不易發(fā)生聚沉和猝滅。Xiang等[33]構(gòu)建載體包埋量子點(diǎn)染料，形成熒光微球，并成功利用電化學(xué)方法對(duì)尿道病原菌進(jìn)行了檢測(cè)，其研制的量子點(diǎn)熒光微球的檢測(cè)靈敏度比市售的商業(yè)化標(biāo)記物高出10多倍。

多元檢測(cè)體系是研究者為了提高檢測(cè)效率，節(jié)約成本，而將多種物質(zhì)在同一試紙條上進(jìn)行檢測(cè)，且相互之間互不干擾，對(duì)多種待測(cè)物含量相關(guān)性的研究意義深遠(yuǎn)。Song Suquan等[34]實(shí)現(xiàn)了在同一膠體金試紙條上同時(shí)檢測(cè)玉米中的嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1，肉眼觀察到的LOD分別為1、50、60 μg/kg，儀器讀取的LOD為0.05、1.00、3.00 μg/kg。李丹妮等[35]制備的熒光免疫層析定量試紙條同時(shí)檢測(cè)克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3 種瘦肉精物質(zhì)的LOD分別可達(dá)0.2、0.4、0.5 μg/L，且與其他同類藥物交叉反應(yīng)率很低，具有良好的特異性。

4 結(jié) 論

通過(guò)EDC-NHS一步法將QBs分別與AOZ、AHD、SEM和AMOZ偶聯(lián)，得到相應(yīng)的QBs探針，在此基礎(chǔ)上結(jié)合多元檢測(cè)體系和QBs熒光免疫檢測(cè)層析技術(shù)，制備硝基呋喃代謝物復(fù)合熒光免疫層析試紙條。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出AOZ、AHD、SEM和AMOZ的LOD分別為0.4、0.4、0.5、0.5 μg/L;通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)對(duì)批內(nèi)和批間的重復(fù)性和準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出試紙條的批內(nèi)檢測(cè)回收率為80%～110%，批內(nèi)變異系數(shù)在15%以內(nèi)，批間回收率為80%～100%，批間變異系數(shù)在15%以內(nèi);且4 種硝基呋喃代謝物AOZ、AHD、SEM和AMOZ之間的交叉反應(yīng)率小于0.1%。

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